Отправлено: 07 февраля 2025, 10:34:33  |
ПРОДОЛЖЕНИЕ 🔻 ➤➤ РИС. 6 Рост мутантов C-конца pUL71. (A) Анализ расширения фокуса указанных вирусов в HFF под слоем метилцеллюлозы. Клетки, инфицированные ЦМВИ, были обнаружены с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания на антиген IE1/2 через 9 дней после заражения (dpi). Каждая точка данных представляет собой относительное количество IE1/2-положительных ядер на фокус. Показан средний размер фокуса для каждого вируса (черная линия), нормализованный по среднему размеру фокуса TB40-BAC4. Для каждого вируса было определено не менее 80 фокусов из трех независимых экспериментов. Проверка значимости проводилась с помощью теста Краскела-Уоллиса, за которым следовал тест множественного сравнения Данна ( P < 0,05). Значимость дана по сравнению с TB40-BAC4 и TB71stop. ***, P < 0,0001; ns, незначимо. (B) Многоступенчатые эксперименты по кинетике роста указанных вирусов проводились путем инфицирования HFF с уровнем инфицирования 0,3%. Выходы вируса в супернатантах инфицированных клеток определялись в указанные моменты времени путем титрования на HFF. Кривые роста показывают средние выходы вируса и стандартные отклонения от трех независимых вирусных супернатантов. Выходы вируса в нулевой момент времени представляют собой начальные уровни инфицирования, определенные через 24 часа после заражения. (C) Одноступенчатые эксперименты по кинетике роста указанных вирусов проводились на HFF с MOI 3. Выходы вируса в супернатантах инфицированных клеток определялись в указанные моменты времени путем титрования на HFF. Кривые роста показывают средние выходы вируса и стандартные отклонения от трех независимых вирусных супернатантов. Выходы вируса в нулевой момент времени представляют собой выходы вируса инокулята. Затем производство и высвобождение инфекционности вирусов с мутацией на С-конце оценивали с помощью многоступенчатой кинетики роста по сравнению с родительским вирусом. Как показано на рис. 6B , выход внеклеточного вируса TB71del327-361, TB71del348-361 и TB71mutK348-351A был снижен в 20 раз по сравнению с выходом вируса TB40-BAC4 и TB71revK348-351A, тогда как вирус TB71stop показал 5000-кратное снижение выхода внеклеточного вируса через 12 дней после заражения. В совокупности промежуточный рост вирусов с мутацией на С-конце и более серьезный дефект роста вируса TB71stop указывают на то, что pUL71 обладает дополнительными функциями, способствующими росту вируса, которые отделены от регуляции вторичной оболочки С-концом pUL71. Теперь возник вопрос, является ли только дефект распространения причиной нарушения роста в эксперименте по многоступенчатой кинетике роста или же на высвобождение вируса также влияет делеция С-конца или мутация мотива тетрализина. Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели эксперимент по одноступенчатой кинетике роста. Поскольку два мутанта делеции вели себя одинаково в предыдущих экспериментах, мы сравнили выход внеклеточного вируса только TB71del348-361 с TB71mutK348-351A, TB40-BAC4 и TB71revK348-351A ( рис. 6C ). Родительские и ревертантные вирусы достигли своего максимального выхода вируса на 7-й день после заражения. В то время оба мутанта показали небольшое снижение выхода внеклеточного вируса примерно в 1,5 раза. Максимальное снижение урожайности вируса TB71mutK348-351A по сравнению с TB40-BAC4 составило примерно 10 раз через 3 дня после заражения. Таким образом, мы предположили, что дефект вторичной оболочки влияет не только на распространение вируса, но и на высвобождение вируса в незначительной степени. Однако мутация мотива тетрализина C-конца в pUL71 повлияла на выход потомства вируса в удивительно малой степени, учитывая глубокое нарушение вторичной оболочки. Трехмерная визуализация тегументации и вторичной оболочки. Наконец, мы попытались исследовать стадии вторичной оболочки с помощью трехмерной электронной микроскопии, чтобы получить больше информации о ее механизме. Вторичная оболочка не очень часто наблюдается в клетках, инфицированных вирусом дикого типа. Чтобы проанализировать достаточное количество различных стадий, мы использовали мутантный вирус TB71mutK348-351A, который демонстрирует морфологически неотличимую вторичную оболочку от вируса дикого типа (почкование отдельных капсидов в небольшие пузырьки) с преимуществом возможности наблюдать увеличенное количество цитоплазматических капсидов, подвергающихся вторичной оболочке. Шестьдесят два капсида на разных стадиях вторичной оболочки были проанализированы из 11 томограмм клеток, инфицированных TB71mutK348-351A, тогда как только 5 почковавшихся капсидов были обнаружены в 8 томограммах клеток, инфицированных вирусом дикого типа. Как показано на рис. 7А , обертывание начинается с капсидов, которые уже украшены электронно-плотным материалом, который, скорее всего, образован белками тегумента. Этот удивительно регулярно расположенный материал выступает из капсидов и контактирует с мембраной. Когда мембрана оборачивается вокруг капсида, этот материал, по-видимому, сохраняет определенное срединное расстояние (приблизительно 36 нм) до мембраны ( рис. 7Б ). Это расстояние в почкующихся капсидах TB71mutK348-351A похоже на то, что измеряется в почкующихся капсидах вируса дикого типа, а также похоже на срединное расстояние во внутриклеточных обернутых капсидах мутанта, а также вируса дикого типа ( рис. 7Б ). ФИГ 7 РИС. 7 Стадии вторичной оболочки ЦМВИ. (A) Капсиды вируса TB71mutK348-351A на разных стадиях вторичной оболочки на основе трехмерной STEM-томографии........ (B) Расстояние между контуром ядра ДНК и обертывающей мембраной (зеленая линия на изображении A1) почковавшихся и обернутых капсидов измерялось на томограммах клеток, инфицированных TB71mutK348-351A и TB40-BAC4. ............. В отличие от тегумента капсидов на начальной стадии обертывания, тегумент во внутриклеточных оболочечных вирионах мутантных и диких вирусов выглядит как однородный электронно-плотный слой без четких структур. Многочисленные стадии обертывания капсидов были зарегистрированы из клеток, инфицированных мутантным вирусом. Интересно отметить, что формирование однородного тегумента, по-видимому, начинается с одной стороны почкующегося капсида. Капсиды на продвинутых стадиях обертывания мембраной, определяемые меньшим расстоянием между двумя плечами обертывающей везикулы, обычно демонстрируют более крупные участки однородного тегумента, что позволяет предположить, что тегумент формируется вместе с процессом вторичного обертывания. Вторичное обертывание завершается событием разрыва мембраны, которое требует предварительного образования узкой шейки почки. Многочисленные капсиды были обнаружены на стадии, когда два плеча обертывающей мембраны были разделены лишь небольшим зазором в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A. Количественный анализ трехмерных данных этих вирусных частиц выявил образование узкой шейки почки на этих везикулах с минимальной наблюдаемой шириной шейки 9,1 нм ( рис. 7C ). Далее мы исследовали, оказывает ли мутация C-конца в pUL71 неблагоприятное воздействие на определенную стадию вторичной оболочки, что привело бы к накоплению капсидов на этой конкретной стадии. Стадии вторичной оболочки были определены на основе расстояния между двумя плечами обертывающей везикулы. На STEM-томограммах это расстояние варьировалось от 9,1 нм (шейка почки) ( рис. 7A , капсид 4) до 206,9 нм (везикула в форме полумесяца) ( рис. 7A , капсид 1). Не было никакого явного накопления капсидов на определенном расстоянии, что позволяет предположить, что мотив тетрализина pUL71 не участвует в определенной стадии вторичной оболочки ( рис. 7C ). Расстояние d в нескольких наблюдаемых почковавшихся капсидах дикого типа было распределено в том же диапазоне, что и в мутантном вирусе. Еще одним интересным наблюдением в томограммах STEM было то, что многие капсиды отпочковывались в везикулы, которые были не просто сферическими, а демонстрировали более сложные формы, часто с трубчатыми расширениями ( рис. 8 и см. также фильм S1 в дополнительном материале). Эти дополнительные трехмерные мембранные особенности обычно не видны на двумерных микрофотографиях, которые получаются из ультратонких срезов. Из-за толщины среза всего 70 нм ультратонкие срезы содержат только небольшую часть этих везикул. Таким образом, в двумерных поперечных сечениях часто оказывается, что капсиды отпочковываются в небольшие сферические везикулы (профиль в форме полумесяца в двух измерениях), которые, по-видимому, не обеспечивают достаточно мембраны для завершения обертывания. ФИГ 8 РИС. 8. Формирование шейки почки (белые наконечники стрелок). Подводя итог, можно сказать, что подробный анализ вторичной оболочки ЦМВИ в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, позволяет предположить скоординированный процесс, посредством которого слой тегумента формируется во время процесса вторичной оболочки, который завершается узкой шейкой почки, имеющей критическую ширину до события разделения. ОБСУЖДЕНИЕ Механизм вторичной оболочки HCMV в настоящее время не изучен. Одним из немногих вирусных белков, которые, как известно, модулируют этот процесс, является pUL71. Интересно отметить, что pUL71 высококонсервативен среди своих гомологов герпесвирусов и, по-видимому, имеет схожие функции, такие как участие во вторичной оболочке ( 14 , 23 , 24 , 27 ). HCMV pUL71 является одним из самых больших белков среди своих гомологов, тогда как его C-конец является наименее консервативной частью. Здесь мы обнаружили, что C-конец pUL71, в частности мотив тетрализина, необходим для эффективной вторичной оболочки HCMV. Это добавляет еще одну важную функциональную область к уже идентифицированным мотивам в N-конце pUL71. Наши новые результаты подчеркивают роль pUL71 в процессе, лежащем в основе почкования капсидов на мембранах, непосредственно перед финальным событием разрыва мембраны, необходимым для завершения вторичной оболочки ЦМВИ. Ультраструктурный анализ выявил функцию С-конца pUL71 во вторичной оболочке. Идентификация мотива тетрализина для вторичной оболочки основывалась, как и в предыдущих анализах мутантных вирусов pUL71, на подробном количественном анализе ТЭМ инфицированных вирусом HFF на поздних стадиях инфекции. Исключительная структурная сохранность биологических мембран с использованием замораживания под высоким давлением и замены замораживания для подготовки образцов ЭМ позволила нам различить и количественно оценить различные стадии созревания, которые проходят цитоплазматические капсиды для получения своей оболочки. Обработка образцов, получение изображений и количественная оценка стадий оболочки в этом исследовании проводились точно так же, как и для других мутантных вирусов pUL71 ( 14 , 26 ), что оправдывает сравнение результатов этого исследования с предыдущими количественными оценками. Кроме того, мы включили хорошо охарактеризованный мутантный вирус с дефицитом UL71, TB71stop, в это исследование для прямого сравнения. В то время как нарушение вторичной оболочки мутантов с делецией С-конца, а также мутанта тетрализина похоже на дефект, количественно определенный при инфекциях TB71stop, другие ультраструктурные характеристики вирусов-мутантов UL71 не были обнаружены, включая увеличенные MVB, почкование многочисленных капсидов в MVB и множественные события почкования капсидов в расширенных мембранных компартментах ( 14 , 25 , 26 ). Это приводит к двум основным выводам. Во-первых, мотив тетрализина С-конца играет роль во вторичной оболочке HCMV, не оказывая видимого влияния на морфологию MVB и других мембран vAC. Таким образом, кажется, что C-конец pUL71 механически участвует в процессе вторичной оболочки. Во-вторых, pUL71 несет в себе дополнительные функции, помимо модуляции вторичной оболочки, которые связаны с организацией мембран vAC и измененной морфологией MVB. Насколько нам известно, эти дополнительные функции pUL71 связаны с мотивом, похожим на лейциновую молнию, участвующим в олигомеризации pUL71 ( 26 ), и мотивом трафика на основе тирозина, регулирующим накопление pUL71 в vAC ( 25 ). Вклад мотива тетрализина pUL71 во вторичную оболочку. Один все еще неотвеченный, но важный вопрос заключается в том, как C-конец и мотив тетрализина способствуют вторичному обертыванию. Из-за отсутствия надежных структурных данных для pUL71 мы можем только предполагать. Однако мы можем исключить, что измененная внутриклеточная локализация pUL71 объясняет нарушение вторичного обертывания при мутации мотива тетрализина ( рис. 4 и 5 ; таблица 1 ). Мы также можем исключить, что немного более низкие уровни белка pUL71 в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, являются причиной из-за неизмененных уровней pUL71 и похожего фенотипа мутантов с укороченным C-концом ( рис. 2A , 3 и 6 ). Механистически pUL71 может выполнять свою роль во вторичном обертывании только тогда, когда он способен ассоциироваться с мембранами в vAC. Недавно было показано, что pUL71 локализуется на цитоплазматической поверхности мембран Гольджи ( 25 ). Поскольку pUL71 не имеет трансмембранного домена, ему требуются средства для связи с мембранами. Лизин является положительно заряженной полярной аминокислотой. При мутации мотива тетрализина положительно заряженные полярные остатки лизина были заменены незаряженными неполярными остатками аланина. Имеются убедительные доказательства того, что положительно заряженные аминокислоты могут напрямую взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами мембраны, такими как фосфолипиды ( 40–43 ). Интересно, что несколько известных доменов связывания липидов, включая домены PH и FYVE, доминируют положительно заряженные аминокислоты, что подтверждает идею о том, что лизин и аргинин взаимодействуют с липидами ( 41 ). Таким образом, C-конец pUL71 может быть вовлечен во взаимодействие с липидами и тем самым способствовать вторичному обертыванию. Эту гипотезу трудно проверить, поскольку мембранное взаимодействие положительно заряженных аминокислот в основном временное и облегчается электростатическим взаимодействием с липидами. Наши данные, показывающие, что мутация мотива тетрализина в незаряженные аланины не оказывает обнаруживаемого эффекта на внутриклеточную локализацию pUL71 и его локализацию на golgin-97-положительных мембранах в vAC, предполагают, что мембранная ассоциация и транспортировка pUL71 не обнаруживаются нарушенными. Это, возможно, неудивительно, учитывая, что pUL71, вероятно, пальмитоилирован по консервативным остаткам цистеина N-конца, подобно его гомологу pUL51 в HSV-1, и что пальмитоилирование облегчает мембранную ассоциацию pUL51 ( 33 ). Белки, которые участвуют в процессе деформации мембраны, таком как обертывание вирусных мембран, часто требуют множественных мембранных взаимодействий ( 44). Следовательно, можно предположить, что мотив тетрализина может, хотя и не требуется для ассоциации pUL71 с мембранами, взаимодействовать с мембраной и выравнивать белок таким образом, что позволяет pUL71 функционировать при деформации и разрыве мембраны. Индукция кривизны мембраны очень важна для процесса вторичного обертывания, поскольку она облегчает поглощение капсида клеточными мембранами. Постулируются три взаимоисключающих способа, с помощью которых белки могут индуцировать кривизну мембраны: (i) механизм скаффолда, (ii) механизм локальной спонтанной кривизны и (iii) механизм двухслойной пары (рассмотренный в ссылке 45 ). Было бы интересно исследовать, использует ли pUL71 какой-либо из этих механизмов для поддержки вторичного обертывания. Также возможно, что мутация тетрализинового мотива изменяет сворачивание белка. В этом контексте положительно заряженные аминокислоты стабилизируют сворачивание белка путем взаимодействия с отрицательно заряженными областями. В настоящее время нам неизвестно, присутствует ли С-концевой тетрализиновый мотив на поверхности или скрыт в контексте свернутого белка. В качестве альтернативы, C-конец может быть вовлечен во взаимодействие с клеточными или вирусными белками, чтобы либо рекрутировать эти белки в vAC, либо сформировать функциональный белковый комплекс. Потенциальными партнерами взаимодействия pUL71, которые были обнаружены при скрининге дрожжей и гибридов, являются UL24, UL26, UL89.2 и UL51 ( 46 ). Однако единственное подтвержденное взаимодействие с pUL71 — это взаимодействие с pUL103 ( 47 , 48 ). Точная роль белкового комплекса для морфогенеза вируса в настоящее время изучается. Другим функциональным аспектом положительно заряженных аминокислотных мотивов для ядерного импорта является их функция в качестве сигналов ядерной локализации (NLS) ( 49 , 50 ). Например, NLS большого Т-антигена вируса обезьян 40 состоит из одного кластера аминокислот PKKKRKV ( 51 , 52 ). Несмотря на отсутствие экспериментальных доказательств, мы считаем маловероятным, что мотив тетрализина функционирует как NLS, поскольку ядерная локализация pUL71 не была обнаружена ни при транзиторной экспрессии ( 25 ), ни при инфекции ( 27 , эта статья). Кроме того, трудно представить, как ядерная локализация pUL71 будет способствовать вторичному обертыванию HCMV. Таким образом, точная функция или вклад мотива тетрализина в процесс вторичной оболочки остается неясным. Было бы очень интересно решить структуру pUL71 в будущих исследованиях, что могло бы помочь прояснить, как C-конец способствует вторичной оболочке ЦМВИ. Влияние нарушения вторичной оболочки на рост вируса. Генерация мутантных вирусов с дефектом вторичной оболочки без влияния на морфологию MVB и других мембран vAC позволила нам определить влияние этого дефекта на распространение и высвобождение вируса. Мутанты с делецией C-конца и мутант тетрализина продемонстрировали нарушение клеточно-ассоциированного распространения и снижение выхода внеклеточного вируса в экспериментах по многоступенчатой кинетике роста, что согласуется с тем, что можно было бы ожидать, когда образуется меньше внутриклеточных частиц с оболочкой ( рис. 6A и B ). Примечательно, что клеточно-ассоциированный рост и высвобождение инфекционности были менее серьезно нарушены у вирусов с мутантами C-конца, чем у мутантного вируса, который не способен экспрессировать pUL71, несмотря на сопоставимое нарушение вторичной оболочки ( таблица 1 и рис. 6A и B ). Более того, 5-кратное уменьшение количества обернутых капсидов в vAC в мутантах pUL71 с С-концевой локализацией привело к уменьшению титров внеклеточного вируса в одношаговой кинетике роста всего в 1,5 раза ( рис. 6C ). Это говорит о том, что вторичное обертывание не является этапом, определяющим скорость высвобождения инфекционных вирусных частиц. Это согласуется с нашим предыдущим трехмерным ультраструктурным исследованием, показывающим, что общее количество обернутых капсидов в одном vAC значительно превышает количество инфекционных вирионов, высвобождаемых из инфицированной клетки ( 3 , 53 ). Учитывая ультраструктурные изменения в клетках, инфицированных вирусом TB71stop, структура и/или происхождение мембран и везикул, в которых происходит вторичная оболочка, также имеют большое значение для эффективности роста вируса и, по-видимому, по крайней мере частично контролируются pUL71. Электронно-микроскопический анализ морфогенеза вируса показывает ультраструктуру инфицированных клеток в данный момент времени. Обнаружение частиц вируса в оболочке в vAC и инфекционного вируса в супернатантах указывает на то, что генерация зрелых вирусных частиц не полностью блокируется в клетках, инфицированных вирусом-мутантом UL71. Однако вторичная оболочка, по-видимому, затруднена, на что указывает накопление капсидов в процессе вторичной оболочки у исследованных мутантов UL71. Трехмерная визуализация почкующихся капсидов позволяет лучше понять тегументацию и вторичную оболочку. Повышенное количество капсидов, подвергающихся обертыванию в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, и схожая морфология этого процесса по сравнению с таковой при заражении вирусом дикого типа позволили нам более подробно изучить различные стадии вторичного обертывания с помощью трехмерной электронной микроскопии. Начало оболочки, по-видимому, не затронуто в мутантных вирусах UL71, поскольку подавляющее большинство капсидов, находящихся в тесном контакте с мембранами, по крайней мере частично окутаны ими. STEM-томография отдельных капсидов на разных стадиях созревания показала, что формирование тегумента происходит по мере прогрессирования оболочки. Мы хотим подчеркнуть, что большая часть этих данных получена из клеток, инфицированных TB71mutK348-351A, и поэтому их следует тщательно интерпретировать относительно стадий оболочки в клетках, инфицированных вирусом дикого типа. Однако мы обнаруживаем похожие стадии в клетках, инфицированных диким типом, хотя и с гораздо меньшей частотой ( таблица 1 и рис. 7B и C ). Такое же исследование в клетках, инфицированных диким типом, потребовало бы от нас получения примерно в десять раз большего количества томограмм, чтобы достичь достаточного количества почковавшихся капсидов для количественного анализа. Со всей должной осторожностью мы постулируем модель формирования тегумента, в которой большинство белков тегумента уже связано с капсидом или мембраной на этапе инициации оболочки ( 16 ) и в которой их концентрация посредством белок-белковых взаимодействий и дальнейших этапов созревания (например, посттрансляционных модификаций) приводит к ультраструктурно однородному слою тегумента. Это представление подтверждается многочисленными данными, сообщающими о накоплении белков тегумента в vAC ( 16 , 19 , 25 ), и согласуется с современной моделью тегументации ( 54–57 ) . Показав, что толщина слоя тегумента была одинаковой у почковавшихся и внутриклеточных обернутых частиц, у нас есть основания полагать, что толщина слоя тегумента полностью устанавливается в начале вторичного обертывания. Регулярно расположенный материал тегумента вокруг капсида, который также наблюдался с помощью STEM-томографии капсидов дикого типа ( 3 ), скорее всего, служит в качестве каркаса для формирующегося тегумента. Процесс обертывания завершается образованием узкой шейки почки с минимальным расстоянием между мембранами 9,1 нм. Эта шейка почки выглядит как небольшое отверстие в мембране обертывающего пузырька в трех измерениях. Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий образование узкой шейки почки во вторичной оболочке герпесвируса с использованием трехмерной электронной микроскопии. По крайней мере, в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, и нескольких капсидах дикого типа не было заметно явного накопления белка в шейке почки. Это контрастирует с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) ( 58 ), где зазор между противоположными мембранами заполнен электронными плотностями, происходящими из клеточных белков, связанных с комплексом сортировки эндосом, необходимым для событий разрыва мембраны, опосредованных транспортом (ESCRT). Однако это следует интерпретировать с осторожностью, поскольку наш метод подготовки отличается от метода, который использовался для изучения ВИЧ-инфекции. Тем не менее, до сих пор неясно, как происходит расщепление мембраны при инфекции ЦМВИ. Отсутствие электронно-плотного материала в шейке почки подтверждает недавно опубликованные данные о том, что механизм ESCRT не требуется для этого процесса при ЦМВИ ( 59 ). Таким образом, можно предположить, что расщепление при инфекции ЦМВИ может быть опосредовано действием вирусных белков, например, pUL71, или с помощью других клеточных белков, которые еще предстоит идентифицировать. Раскрытие механизма вторичной оболочки, безусловно, потребует гораздо больше работы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки. Фибробласты крайней плоти человека (HFF) поддерживались в минимальной необходимой среде (MEM; Gibco-BRL) и использовались до пассажа 23. Фибробласты легких эмбриона человека (MRC-5; Европейская коллекция клеточных культур) поддерживались в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Gibco-BRL) и использовались между пассажами 21 и 30 для восстановления вируса. Как MEM, так и DMEM были дополнены 2 мМ l -глутамином (200 мМ; PAA Laboratories), 10% сыворотки плода теленка, 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина (все три от Gibco-BRL) и 1× заменимыми аминокислотами (Biochrom AG). Генерация мутантных вирусов. Родительский вирус всех рекомбинантных вирусов этого исследования был воссоздан из клона бактериальной искусственной хромосомы ЦМВИ TB40-BAC4, полученного из эндотелиотропного штамма ЦМВИ TB/40E (номер доступа EF999921.1 [ 35 ]). Рекомбинантные вирусы были получены с использованием безмаркерной двухэтапной рекомбинации RED-GAM, как описано ранее ( 60 , 61 ). В этом методе рекомбинации используются праймеры, которые содержат гомологию с последовательностью UL71 выше и ниже последовательности, подлежащей мутации, а также гомологию с плазмидой-шаблоном pEPkan-S ( 60 ). ......... Секвенирование мутировавших участков подтвердило правильность введения мутаций. Бакмиды рекомбинантных вирусов ЦМВИ были воссозданы в MRC-5, как описано ранее ( 62 , 63 ). Затем HFF использовались для дальнейшего размножения вируса и генерации вирусных запасов. Генерация вируса с дефицитом UL71 (TB71stop) описана в другом месте ( 14 ). Антитела. HCMV и клеточные белки были обнаружены с помощью моноклональных антител (MAb) в непрямых иммунофлуоресцентных окрашиваниях, вестерн-блот-анализах, анализах расширения фокуса и титрованиях вируса. Мышиные MAb были направлены против HCMV IE1/2 (MAb 63-27), главного капсидного белка HCMV (MCP; MAb 28-4), pp65 (pUL83; MAb 65-33, любезно предоставленного W. Britt, Университет Алабамы, Бирмингем), pp28 (клон 5C3; Santa Cruz Biotechnology), клеточного golgin-97 (IgG1; Invitrogen) и клеточного актина (Sigma). HCMV pUL71 был обнаружен в экспериментах по непрямой иммунофлуоресценции и вестерн-блот-анализах с помощью поликлонального антитела, полученного против C-конца pUL71 (аминокислоты [aa] 162–361) ( 14 ). В экспериментах по непрямой иммунофлуоресценции и анализах расширения фокуса в качестве вторичных антител использовались козьи антикроличьи и козьи антимышиные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor (AF) 488 или AF555 (Invitrogen). В качестве вторичных антител в анализах вестерн-блоттинга использовались козьи антимышиные или козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с StarBright Blue 700 или StarBright Blue 520 (Bio-Rad). Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание. HFF были посеяны в 8-луночных слайдах μ-Slide (Ibidi GmbH; Германия) и синхронизированы путем голодания сыворотки в течение 48 ч до заражения соответствующими вирусами при множественности заражения (MOI) 1. В разное время после заражения клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 10 мин при 4°C. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано ранее ( 16 , 25 ). Вкратце, клетки были пермеабилизованы 0,1% Triton X-100, а неспецифические сайты связывания были блокированы PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина и 10% человеческой сыворотки от ЦМВИ-отрицательных лиц. Первичные и вторичные антитела были разведены в блокирующем растворе. ДНК окрашивали 30 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; Roche), разведенного в PBS. Конфокальные изображения получали с помощью объектива 63× флуоресцентного микроскопа Axio-Observer.Z1, оснащенного Apotome, а изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения Zen 2.3 (Zeiss). Анализ роста вирусов. Для экспериментов по многоэтапной кинетике роста конфлюэнтные HFF инфицировались в трех повторностях с частотой заражения приблизительно 0,3% для каждого вируса. Титры инокулята рассчитывались на основе фактической частоты заражения, которая определялась через 24 ч после заражения путем обнаружения IE-позитивных клеток. Первые супернатанты собирались через 24 ч после заражения путем удаления входящего вируса с последующими тремя промывками теплым PBS, добавлением полной MEM и инкубацией в течение 10 мин при 37 °C (день 1). Дополнительные супернатанты собирались на 3, 6, 9 и 12 день после заражения. Все супернатанты хранились при температуре -80 °C до титрования. Для экспериментов по одноэтапной кинетике роста конфлюэнтные HFF были инфицированы в дубликатах при MOI 3. Для контроля за той же начальной инфекцией выход вируса инокулята определялся на HFF путем титрования. Введенный вирус удалялся, клетки промывались теплым PBS, и свежий MEM добавлялся через 90 минут после заражения. Супернатанты собирались каждые 24 часа и хранились при температуре -80°C. Определение выхода вируса в инокуляте и собранных супернатантах из экспериментов по многоэтапной и одноэтапной кинетике роста проводилось в трех повторах путем титрования на HFF, как описано ранее ( 14 ). Способность клеточно-ассоциированного распространения определялась в анализе на расширение фокуса, как описано ранее ( 25 ). Вкратце, конфлюэнтные HFF в 12-луночных планшетах (2 × 10 5 HFF/лунку) были инфицированы 50, 100 и 150 БОЕ/лунку соответствующего вируса. Через 24 часа клетки тщательно промывали теплым PBS и культивировали еще 24 часа в свежей MEM. Клетки содержались под слоем 0,65% метилцеллюлозы с 3 дней после заражения до тех пор, пока среда не была удалена, а затем клетки промывали теплым PBS и фиксировали ледяным метанолом в течение 10 минут при -20°C на 9-й день заражения. Клетки, инфицированные ЦМВИ, были обнаружены путем окрашивания антигена IE1/2. Ядра были контрастно окрашены DAPI. Эксперимент повторяли три раза, и не менее 50 очагов каждого эксперимента и вируса были получены в флуоресцентном микроскопе Axio-Observer.Z1 с объективом 10×. Количество IE-положительных ядер каждого очага определяли с помощью программного обеспечения ImageJ ( 64 ) с плагином cell-counter ( https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ; Курт Де Вос, Университет Шеффилда, Академическая неврология). Средний размер очага для каждого вируса рассчитывали и нормализовали по среднему размеру очага в лунках, инфицированных TB40-BAC4, а статистический анализ проводили с помощью теста Крускала-Уоллиса ( P < 0,05) с последующим тестом множественного сравнения Данна ( P < 0,05). Электронная микроскопия. Подготовка образцов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и количественные исследования морфогенеза вируса с помощью ПЭМ были выполнены, как описано ранее ( 3 ). Короче говоря, HFF выращивались на покрытых углеродом сапфировых дисках (диаметр 3 мм, толщина 50 мкм; Wohlwend GmbH), инфицированных соответствующими вирусами при MOI 1 и зафиксированных через 120 ч после заражения путем замораживания под высоким давлением (HPF Compact 01; Wohlwend GmbH) с последующим замещением замораживанием ( 13 ) и пошаговым встраиванием в эпоксидную смолу (Fluka). Ультратонкие срезы толщиной 70 нм клеток, инфицированных ЦМВИ, исследовались с помощью ПЭМ JEM-1400 (Jeol), оснащенного камерой с зарядовой связью (CCD), при ускоряющем напряжении 120 кВ. Оболочечные, почкующиеся и голые цитоплазматические капсиды количественно определялись на микрофотографиях областей vAC случайно выбранных инфицированных вирусом клеток из по меньшей мере трех независимых экспериментов для каждого вируса. Фиксация и внедрение инфицированных клеток для STEM-томографии были такими же, как описано для TEM. Последующие этапы подготовки образцов проводились, как описано ранее ( 65 , 66 ). Вкратце, срезы инфицированных клеток толщиной от 500 до 700 нм были подготовлены и закреплены на сетках EM с 200 параллельными прутьями сетки (Plano), которые были предварительно обработаны поли- l -лизином (10% в воде). Закрепленные срезы были снова обработаны поли- l -лизином перед прикреплением коллоидных золотых проверочных знаков и, наконец, покрыты слоем углерода толщиной 5 нм. Получение томограммы проводилось на STEM JEM-2100F (Jeol) с ускоряющим напряжением 200 кВ. Серии наклонов были получены от по крайней мере +68° до −68° с шагом 1,5° с использованием детектора светлого поля. Серии изображений были реконструированы в томограммы с помощью взвешенной обратной проекции с помощью программного пакета IMOD ( 67 ). Расстояние между двумя плечами обертывающей везикулы измерялось по виртуальным сечениям томограмм почкующихся капсидов с помощью программного обеспечения IMOD ( рис. 7 ). Расстояния были определены для 62 капсидов мутанта TB71mutK348-351A по 11 томограммам и 5 капсидов вируса TB40-BAC4 по 8 томограммам. Кроме того, расстояние между ядром ДНК и мембраной (толщина тегумента плюс толщина оболочки капсида) измерялось в виртуальных сечениях для 38/75 (обернутых/почкующихся) капсидов по 11 томограммам мутантного вируса и 26/9 (обернутых/почкующихся) капсидов по 8 томограммам вируса дикого типа. Трехмерная визуализация почковавшихся капсидов была выполнена с использованием программного обеспечения Avizo 6.3 (Visualization Science Group, Берлингтон, Массачусетс, США) путем ручной сегментации мембраны и структуры капсида. Пороговая сегментация использовалась для визуализации плотностей тегумента в этих трехмерных реконструкциях.
Уважаемейшая, Pipa, в этих описанных модификациях кроется и специфическая ВИДОВАЯ активность некоторых вирусов тока в рамках нкого вида животных, что не исключает и появления высоко-патогенных штаммов, именно ввиду проявления СИНЕРГЕТИКИ в специфике сборки Вирионов и в других видах с появлением Пандемий. Но такие вирусы должны быстро вырождаться, ибо у них эволюционная настройка тока на другой вид животных, и они не могут эволюционировать в рамках только человеческих существ.
|
Отправлено: 07 февраля 2025, 10:30:26 |
Естественный иммунитет, в долгосрочной перспективе, по определению сильнее вакцинного! Этот профессор совершенно прав - естественный иммунитет действительно сильнее вакцинного (первый обычно сохраняется в течение года, а второй только полгода). Но разве из его слов следует, что вакциноваться не надо, а надо ждать пока не заболеешь? Ведь естественный иммунитет, как бы он ни был хорош, можно приобрести лишь переболев ковидом, а это очень большой риск. Вот инфа по вашей, Уважаемейшая, Pipa, идее о модификации Шипа вируса COVID-19 (SARS-CoV-2) более сильно основным агентом (статья в ПУБМед): - Кстати, Тетрализин (как и апоферрин и оксидированные наночастицы ГРАФЕНА (что подобно (даже по хим-формуле) как и всякая высоко-моллекулярная ароматика проявляет канцерогенность ввиду генных модификаций) есть ещё специфическими генными модификаторами и челноками доставки в клетки ДНК и Плазмид) модифицирует и неэффективные антибиотики и холевую кислоту, делая их активными противомикробами (ССЫЛКА), ну и пр.)
Регуляция вторичной оболочки человеческого цитомегаловируса с помощью мотива тетрализина C-конца в pUL71 Регуляция вторичной оболочки человеческого цитомегаловируса с помощью мотива тетрализина C-конца в pUL71 Авторы : Кларисса Рид , Мартин Шауфлингер , Дмитрий Николаенко , Пауль Вальтер , Йенс фон Эйнем Информация об авторах и принадлежность к ним https://doi.org/10.1128/jvi.02244-18PDF/EPUB --------- ОВИ; Том 93 , Номер 13; 1 июля 2019 г. АБСТРАКТНЫЙ (Аннотация): Для вторичной оболочки человеческого цитомегаловируса (HCMV) необходим вирусный белок тегумента pUL71. Отсутствие pUL71 приводит к сложному ультраструктурному фенотипу с увеличенным числом вирусных капсидов, подвергающихся обертыванию в цитоплазматическом комплексе сборки вируса. Здесь мы сообщаем о роли C-конца pUL71 во вторичной обертке. Мутантные вирусы, экспрессирующие укороченный с C-конца pUL71 (TB71del327-361 и TB71del348-351), продемонстрировали нарушенную вторичную обертку в исследованиях с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Дальнейший мутационный анализ C-конца выявил мотив тетрализина, мутация которого (TB71mutK348-351A) привела к дефекту оболочки, который был неотличим от дефекта, вызванного усечением C-конца pUL71. Интересно, что не все морфологические изменения, которые определяют ультраструктурный фенотип вируса TB71stop, были обнаружены в клетках, инфицированных вирусами с мутацией на С-конце. Это говорит о том, что pUL71 обеспечивает дополнительные функции, которые модулируют морфогенез ЦМВИ и скрываются в другом месте pUL71. Это также отражается в промежуточном дефекте роста вирусов с мутацией на С-конце по сравнению с ростом вируса TB71stop. Электронная томография и трехмерная визуализация различных стадий вторичной оболочки в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, однозначно показали образование шейки почки. Кроме того, мы приводим доказательства прогрессивного образования тегумента, связанного с прогрессирующими степенями оболочки капсида, что позволяет предположить, что тегументация и оболочка являются взаимосвязанными процессами. В целом мы определили важность C-конца pUL71 и, в частности, положительно заряженного мотива тетрализина для вторичной оболочки ЦМВИ. ВАЖНОСТЬ Человеческий цитомегаловирус (ЦМВ) является важным человеческим патогеном, который вызывает тяжелые симптомы, особенно у хозяев с ослабленным иммунитетом. Кроме того, врожденная инфекция ЦМВ является ведущей вирусной причиной тяжелых врожденных дефектов. Разработка противовирусных препаратов для предотвращения образования инфекционного потомства вируса является сложной задачей из-за сложного и многоэтапного морфогенеза вириона. Механизм вторичной оболочки до сих пор не полностью изучен; тем не менее, он представляет собой потенциальную цель для противовирусных препаратов. Наша идентификация роли положительно заряженного мотива в конце C pUL71 для эффективной вторичной оболочки ЦМВ подчеркивает важность pUL71 и, особенно, его конца C для этого процесса. Кроме того, он показывает, как клеточно-ассоциированное распространение и высвобождение вириона зависят от вторичной оболочки. Ультраструктурный анализ различных стадий оболочки способствует лучшему пониманию механизмов, лежащих в основе процесса вторичной оболочки. Это может приблизить нас к разработке новых концепций лечения инфекций ЦМВ. ВВЕДЕНИЕ Человеческий бета-герпесвирус 5 , также известный как человеческий цитомегаловирус (ЦМВ), является глобально распространенным патогеном, который вызывает серьезные нарушения у хозяев с ослабленным иммунитетом. ЦМВ также является основной вирусной причиной родовых осложнений у новорожденных после врожденной инфекции ( 1 ). Зрелые вирионы ЦМВ демонстрируют характерную организацию герпесвируса, состоящую из четырех основных структурных компонентов, которые можно однозначно идентифицировать на электронных микрофотографиях ( 2 , 3 ). Икосаэдрический капсид имеет электронно-плотное ядро, которое содержит плотно упакованный двухцепочечный геном ДНК. Капсид окружен слоем в основном вирусных, но также и клеточных белков, называемым тегументом, который соединяет капсид с вирусной оболочкой ( 4 ). Последняя представляет собой липидный бислой, полученный из клетки-хозяина, и содержит несколько вирусных гликопротеиновых комплексов. Морфогенез вириона завершается в процессе, регулируемом вирусом, называемом вторичной оболочкой, в ходе которой капсиды приобретают свою оболочку. Вторичная оболочка происходит в цитоплазме инфицированных клеток в перинуклеарной области, комплексе сборки вируса (vAC) ( 5 ). vAC формируется вокруг центриолей во время заражения ЦМВИ путем вызванной вирусом перестройки микротрубочек и цитоплазматических мембран ( 6 – 11 ). Мембраны, участвующие в формировании vAC, в частности, принадлежат аппарату Гольджи и секреторным и эндоцитозным путям ( 6 – 9 , 12 ). Из-за высокого разрешения, необходимого для визуализации вторичной оболочки, наше текущее понимание этого процесса получено в основном из изучения морфогенеза вируса с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Внедрение передовых методов подготовки образцов, таких как замораживание под высоким давлением и замещение замораживанием, привело к улучшению сохранности вирусных и клеточных структур, особенно мембран, и, таким образом, обеспечивает высококачественные и высокоразрешающие микрофотографии ( 3 , 13 , 14 ). Предыдущие исследования показали, что вторичная оболочка ЦМВИ является многоступенчатым процессом ( 3 ). В соответствии с этим можно наблюдать различные стадии созревания, три из которых можно легко классифицировать на основе их внешнего вида на микрофотографиях ПЭМ. Цитоплазматические капсиды на первой стадии созревания частично покрыты тегументом, но не связаны с мембранами. Капсиды на более поздних стадиях контактируют с мембранами, которые оборачиваются вокруг капсида, образуя оболочку, процесс также называемый почкованием. Процесс почкования/обертывания завершается событием разрыва мембраны, в результате чего внутри везикулы образуется обернутый капсид, что является третьей стадией созревания. Эти внутриклеточные обернутые капсиды морфологически идентичны зрелым внеклеточным вирионам. Внутриклеточные обернутые капсиды транспортируются внутри везикул к плазматической мембране, где они высвобождаются во внеклеточное пространство путем слияния мембраны везикулы с плазматической мембраной. Движущие силы для изгиба мембраны во время вторичной оболочки HCMV и разрыва мембраны до сих пор неизвестны. Есть некоторые доказательства того, что почкование и разрыв мембраны регулируются вирусными белками ( 14–22 ). Одним из вирусных белков с зарегистрированной функцией вторичной оболочки HCMV является белок тегумента pUL71 ( 14 ) . HCMV pUL71 сохраняется во всех подсемействах герпесвирусов, например, pUL51 в альфагерпесвирусах вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) и вирусе псевдобешенства (PrV) и BSRF1 в гаммагерпесвирусе вируса Эпштейна-Барр (EBV). Подобно HCMV pUL71, белки pUL51 HSV-1 и PrV участвуют во вторичной оболочке, а мутантные вирусы, у которых отсутствует pUL51, нарушают распространение и высвобождение вируса ( 23 , 24 ). В клетках, инфицированных ЦМВИ , pUL71 накапливается в vAC, что согласуется с функцией pUL71 во вторичной оболочке ( 14 , 25–27 ) . Его функция для вторичной оболочки ЦМВИ была определена с помощью количественного ультраструктурного анализа, показывающего, что отсутствие pUL71 приводит к накоплению почкующихся капсидов в vAC и, следовательно, к уменьшению соотношения обернутых капсидов. Дефект оболочки дополнительно характеризуется образованием расширенных мембранных отсеков, связанных с множественными событиями почкования. Кроме того, вирусные капсиды накапливались на мембране и внутри увеличенных мультивезикулярных тел (MVB) на периферии vAC ( 14 ). Эти структурные изменения связаны с нарушением высвобождения вируса и его распространения. С 361 аминокислотой HCMV pUL71 является одним из крупнейших гомологов герпесвируса ( 14 , 24 , 28–31 ). Сравнение последовательностей показало, что N-конец высококонсервативен, тогда как C-конец демонстрирует низкую гомологию последовательностей ( 32 ). Мы и другие идентифицировали важные функциональные домены в N-конце pUL71 и его гомологов. Было показано, что HSV-1 pUL51 пальмитоилирован ( 33 ). Кроме того, на N-конце была идентифицирована специфическая для типа клеток функция HSV-1 pUL51 для распространения от клетки к клетке; однако мутация мотива не оказала влияния на высвобождение вируса, что предполагает частичное функциональное разъединение репликации, высвобождения и распространения от клетки к клетке HSV-1 pUL51 ( 34 ) . HCMV pUL71 содержит базовый домен, подобный лейциновой молнии, который участвует в олигомеризации pUL71. Мутация этого мотива не изменила локализацию или уровни pUL71 в vAC, но привела к дефектному росту вируса и вторичной оболочке, сопоставимой с таковой у мутанта вируса, лишенного pUL71 ( 26 ). Недавно мы сообщили об эндоцитарной транспортировке HCMV pUL71 из плазматической мембраны в мембраны vAC и необходимости мотива транспортировки на основе N-концевого тирозина ( 25 ). Нарушение этого мотива приводит к нарушению роста вируса и дефекту вторичной оболочки, аналогичному тому, что было описано для мутанта вируса с дефицитом pUL71. Здесь мы исследовали роль С-конца pUL71 для вторичной оболочки ЦМВИ. Были получены и проанализированы с помощью ТЭМ два мутантных вируса, экспрессирующих укороченные с С-конца версии pUL71. Оба мутантных вируса продемонстрировали нарушенную вторичную оболочку, похожую на таковую у вируса TB71stop, но не имели других ультраструктурных изменений, таких как увеличенные МВБ или расширенные мембранные отсеки с множественными событиями почкования. Последующий целевой мутагенез на С-конце выявил положительно заряженный мотив тетрализина в положении 348–351. Мутации этого мотива было достаточно, чтобы вызвать дефект вторичной оболочки, который наблюдался у укороченных с С-конца мутантов. Мутантные вирусы с С-концом продемонстрировали лучший рост и распространение, чем вирус TB71stop, хотя все мутантные вирусы показали схожее увеличение соотношения необолочечных капсидов в vAC. С помощью сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (СТЭМ) томографии капсидов на различных стадиях вторичной оболочки мы обнаружили доказательства прогрессивного образования тегумента, связанного с прогрессирующими степенями оболочки капсида, что позволяет предположить, что эти процессы переплетены. Используя трехмерную электронную микроскопию, мы также впервые показываем, что процесс оболочки приводит к образованию узкой шейки почки. В заключение мы продемонстрировали важность мотива тетрализина С-конца для регуляции вторичной оболочки и исследовали тегументацию и вторичную оболочку с помощью трехмерной электронной микроскопии. РЕЗУЛЬТАТЫ
Создание и характеристика мутантов вируса pUL71 с укороченным С-концом. Предыдущие исследования показали важную роль белка оболочки HCMV pUL71 для поздних стадий морфогенеза вириона, в частности, для процесса вторичной оболочки ( 14 , 26 , 27 ). Ультраструктурный фенотип вируса UL71-stop довольно сложен и не ограничивается дефектом только вторичной оболочки. Два функциональных мотива, расположенных на N-конце pUL71, базовый домен, подобный лейциновой молнии, необходимый для олигомеризации pUL71, и мотив трафика на основе тирозина, необходимый для локализации pUL71 в vAC, уже были идентифицированы как имеющие решающее значение для функции pUL71 во вторичной оболочке ( рис. 1A ). Среди его гомологов вируса герпеса человека HCMV pUL71 является крупнейшим представителем. Интересно, что C-конец является наименее консервативной частью при сравнении последовательностей гомологов pUL71 ( 32 ). Из-за сложного ультраструктурного фенотипа в отсутствие pUL71 и низкой консервативности C-конца pUL71 мы предположили, что C-конец может содержать функциональные домены, которые, по крайней мере, частично способствуют фенотипу. ФИГ. 1 РИС. 1 (A) Выравнивание последовательностей HCMV pUL71 ( APG57260.1 ) и HSV pUL51 ( ALM22621.1 ) с помощью онлайн-инструмента MUSCLE ( 68 ). Звездочками отмечены два предсказанных сайта пальмитоилирования pUL71 (CSS-Palm 4.0). Мотивы, которые, как было показано, функциональны во время морфогенеза вируса, следующие: 1, сайт пальмитоилирования pUL51 ( 33 ); 2 и 3, мотивы трафика на основе тирозина в pUL71 и pUL51 ( 25 , 34 ); 4, основной мотив, подобный лейциновой молнии, в pUL71 ( 26 ); 5, сайт фосфорилирования pUL51 ( 69 ); 6, мотив тетрализина pUL71 (данное исследование). (B) Генерация вирусов-мутантов C-конца pUL71. Показана геномная организация выше и ниже гена UL71 в родительском вирусе TB40-BAC4 и аминокислотная последовательность pUL71 в указанных мутантных вирусах. TB71del327-361 и TB71del348-361 экспрессируют укороченные с C-конца версии pUL71. Мутация подчеркнутых аминокислот в аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, привела к точечным мутантам TB71mutK348-351A и TB71mutL357-358A. Ревертантный вирус TB71revK348-351A был получен путем восстановления аминокислотной последовательности TB71mutK348-351A до последовательности родительского вируса TB40-BAC4. Мы проверили эту гипотезу, создав два рекомбинантных вируса, экспрессирующих укороченные на С-конце формы pUL71 на фоне инфекционного бактериального искусственного клона хромосомы (BAC) TB40-BAC4 эндотелиотропного штамма HCMV TB40/E ( 35 ). У одного мутанта отсутствовали последние 35 аминокислот C-конца (TB71del327-361), тогда как введение преждевременного стоп-кодона в кодоне 348 во втором мутанте привело к экспрессии укороченного pUL71, в котором отсутствовали последние 14 аминокислот C-конца (TB71del348-361) (обзор на рис. 1B ). Анализ последовательности мутировавших областей подтвердил целостность созданных мутантов. Оба мутантных вируса были реконструированы путем электропорации соответствующих ДНК BAC в фибробласты человека. Для подтверждения экспрессии укороченных версий pUL71 лизаты человеческих фибробластов крайней плоти (HFF), инфицированных мутантным и диким типом вируса, через 120 ч после инфицирования были исследованы с помощью вестерн-блоттинга. Поликлональное антитело против pUL71 ( 14 ) обнаружило специфические полосы с более низкой молекулярной массой в лизатах клеток, инфицированных TB71del327-361 и TB71del348-361, чем у полноразмерного pUL71 в лизатах клеток, инфицированных диким типом вируса ( рис. 2A ). Кроме того, сопоставимые интенсивности полос pUL71 во всех лизатах клеток, инфицированных вирусом, показали, что ни экспрессия, ни стабильность pUL71 не были существенно затронуты усечениями С-конца. ФИГ. 2 РИС. 2 Характеристика мутантов с делецией C-конца pUL71. (A) Лизаты клеток TB40-BAC4-, TB71del327-361-, TB71del348-361- и ложноинфицированных HFF (через 120 ч после заражения) были обработаны для анализа вестерн-блоттинга. Блот был исследован антителами против вирусного IE, pp65, pp28, pUL71 и клеточного актина. (B) Представительные конфокальные изображения субклеточной локализации pUL71 (зеленый) и транс-белка сети Гольджи golgin-97 (красный) в HFF, инфицированных указанными вирусами (MOI 1) через 120 ч после заражения. Ядра были окрашены DAPI (белый). Масштабные линейки: 10 мкм. Далее мы исследовали, влияет ли на субклеточную локализацию pUL71 усечение C-конца, поскольку перемещение pUL71 в vAC необходимо для его функционирования во время инфекции ( 25 ). Внутриклеточная локализация обеих усеченных с C-конца форм pUL71, 71del327-361 и 71del348-361, была неотличима от локализации полноразмерного pUL71 через 120 ч после заражения и демонстрировала перекрывающиеся сигналы к клеточному маркерному белку Гольджи golgin-97, что указывает на то, что усечение C-конца не оказало существенного влияния на внутриклеточный перемещение pUL71 в vAC и его накопление в этом месте ( рис. 2B ). C-конец pUL71 участвует во вторичной обертке. Ранее было показано, что морфогенез вириона ЦМВИ, в частности, вторичная оболочка, серьезно нарушен в клетках, инфицированных вирусом UL71-stop ( 14 ). Поскольку вторичная оболочка может быть визуализирована только с помощью электронной микроскопии, мы провели ультраструктурный анализ для изучения роли C-конца pUL71 для вторичной оболочки ЦМВИ. HFF были инфицированы родительским TB40-BAC4, мутантными вирусами TB71del327-361, TB71del348-361 и ранее опубликованным вирусом TB71stop ( 14 ). Инфицированные клетки были подготовлены для анализа ТЭМ путем замораживания под высоким давлением и замены замораживанием через 120 ч после заражения. Этот протокол подготовки образцов сохраняет клеточные мембраны, близкие к их нативному состоянию, и обеспечивает превосходный мембранный контраст ( 13 ), что имеет решающее значение для количественной оценки различных стадий оболочки вирусных частиц в vAC. Вирусные частицы на двухмерных микрофотографиях ультратонких срезов области vAC оценивались с точки зрения стадии их обертывания и делились на три категории ( 14 ). Категория I (голые) включает необолочковые цитоплазматические капсиды, которые не контактируют с клеточными мембранами. Категория II (почкование) включает все те капсиды, которые находятся в процессе почкования, характеризующемся изгибом мембран вокруг капсидов. Категория III (оболочечные) содержит капсиды, которые окружены полной оболочкой. Количественный анализ не менее 15 клеток для каждого вируса показал, что большинство капсидов (83,9%) в vAC были обернуты в родительские фибробласты, инфицированные вирусом TB40-BAC4, в то время как только 15,5% всех капсидов подверглись почкованию ( рис. 3 , слева, и таблица 1 ). Напротив, только приблизительно 30% цитоплазматических капсидов обоих укороченных на С-конце мутантов были обернуты, в то время как большинство капсидов (65,5% и 72,1%) находились в процессе почкования на мембранах небольших везикул ( рис. 3 , справа). Эти результаты показали, что последние 14 С-концевых аминокислот pUL71 необходимы для эффективного вторичного обертывания HCMV. ФИГ. 3 РИС. 3 (A) Электронные микрофотографии vAC HFF, инфицированных ЦМВИ TB40-BAC4 (слева) и TB71del327-361 (справа), через 120 ч после заражения. (B) Более сильное увеличение выбранных областей на панели A показывает полностью обернутые вирусные капсиды (черные стрелки) в клетках, инфицированных TB40-BAC4 (слева), тогда как клетки, инфицированные вирусом TB71del327-361 (справа), содержат большое количество капсидов в процессе вторичной оболочки (белые стрелки). ТАБЛИЦА 1 ТАБЛИЦА 1 Ультраструктурная количественная оценка вторичной оболочки вирусных частиц ЦМВИ в vAC инфицированных HFF через 120 ч после заражения .............................................. Приведены средние проценты и стандартные отклонения (SD) частиц в оболочке, почковавшихся частиц (частиц без оболочки, прикрепленных к мембранам) и голых частиц (частиц без оболочки, не прикрепленных к мембранам) по данным как минимум двух независимых экспериментов. Для каждого вируса жирным шрифтом выделена стадия вторичной оболочки, на которой было подсчитано большинство частиц. Другим интересным открытием этого исследования ТЭМ было то, что вторичное обертывание капсидов преимущественно обнаруживалось как почкование отдельных капсидов в небольшие серповидные везикулы в клетках, инфицированных TB71del327-361 и TB71del348-361 ( рис. 3 , справа). Следовательно, большинство обернутых капсидов также обнаруживались как отдельные капсиды внутри небольших везикул в этих клетках, инфицированных мутантным вирусом, что является преобладающим фенотипом обернутых частиц в клетках, инфицированных родительским вирусом. Это контрастирует с вирусом UL71-stop, где часто наблюдаются множественные события почкования в крупные везикулы ( 14 ). Из этого мы сделали вывод, что усечение последних 14 аминокислот pUL71 приводит к дефектному вторичному обертыванию, не влияя на общую морфологию мембран vAC. Идентификация функциональных доменов C-конца pUL71. Дефект вторичной оболочки у мутантных вирусов, экспрессирующих укороченный на С-конце pUL71, указывает на то, что 14 крайних С-концевых аминокислот выполняют функцию, которая участвует в регуляции процесса вторичной оболочки. Исследование последовательности выявило два мотива в пределах 14 крайних С-концевых аминокислот: мотив дилейцина ( 357 LL 358 ) и положительно заряженный мотив тетрализина ( 348 KKKK 351 ). Мотивы дилейцина являются известными транспортными мотивами, которые регулируют сортировку трансмембранных белков в эндосомы и лизосомы ( 36 , 37 ). Функция положительно заряженных аминокислот менее ясна. Они часто являются частью сигналов ядерной локализации ( 38 , 39 ) , но также опосредуют мембранную ассоциацию белков путем их взаимодействия с отрицательно заряженными фосфолипидами ( 40–43 ) . Чтобы выяснить, выполняет ли один из этих двух мотивов функцию вторичной оболочки, были созданы два дополнительных рекомбинантных вируса, в которых либо мотив дилейцина (TB71mutL357-358A), либо мотив тетрализина (TB71mutK348-351A) был мутирован в остатки аланина ( рис. 1A ). Сначала мы проанализировали экспрессию точечно-мутированных версий pUL71 с помощью вестерн-блоттинга. Уровни белка pUL71 были схожи в лизатах клеток, инфицированных вирусом TB71mutL357-358A, и клеток, инфицированных вирусом TB40-BAC4 ( рис. 4A ). Интересно, что мутантный белок pUL71mutK348-351A продемонстрировал немного более быструю миграцию в вестерн-блоттинге, чем дикий тип pUL71, что, вероятно, вызвано заменой четырех остатков лизина на более мелкие остатки аланина. Чтобы исключить нежелательные мутации в других местах мутанта TB71mutK348-351A, был создан ревертантный вирус, в котором четыре остатка лизина с 348 по 351 были повторно введены (TB71revK348-351A). Уровни белка и характер миграции восстановленного pUL71 были аналогичны таковым для pUL71 дикого типа в анализе вестерн-блоттинга, что указывает на то, что мутация K348-351A объясняет наблюдаемые изменения pUL71 при инфекциях TB71mutK348-351A. ФИГ. 4 РИС. 4 Характеристика мутантов C-концевой точки pUL71. (A) Вестерн-блот-анализ клеточных лизатов TB40-BAC4, TB71mutL357-358A, TB71mutK348-351A и TB71revK348-351A (через 120 ч после заражения). Блот исследовали антителами против IE, pp65, pp28, pUL71 и клеточного актина. (B) Репрезентативные конфокальные изображения субклеточной локализации pUL71 (зеленый) и транс-белка сети Гольджи golgin-97 (красный) в HFF, инфицированных указанными вирусами (MOI 1) через 120 ч после заражения. Ядра окрашивали DAPI (белый). Масштабные линейки: 10 мкм. Как и ожидалось, точечные мутанты TB71mutK348-351A и TB71mutL357-358A продемонстрировали внутриклеточную локализацию в vAC, неотличимую от локализации pUL71 в TB40-BAC4 и ревертантной вирусной инфекции ( рис. 4B ), что соответствует мутантам с делецией C-конца. Регуляция вторичной оболочки с помощью С-концевого тетрализинового мотива. Для анализа важности мотивов дилейцина ( 357 LL 358 ) и тетрализина ( 348 KKKK 351 ) для морфогенеза ЦМВИ HFF были инфицированы вирусами TB71mutL357-358A и TB71mutK348-351A и подвергнуты количественному анализу ТЭМ вторичной оболочки через 120 ч после заражения. Большинство (82,5%) всех капсидов в области vAC были обернуты в клетки, инфицированные вирусом TB71mutL357-358A ( таблица 1 ), что указывает на то, что мутация мотива дилейцина C-конца на два аланина не оказала неблагоприятного воздействия на вторичную оболочку. Таким образом, точечный мутант TB71mutL357-358A был исключен из дальнейших исследований. Напротив, только 21,9% всех капсидов были обернуты в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A ( таблица 1 ), что сопоставимо с результатами, полученными в клетках, инфицированных вирусом TB71del327-361, TB71del348-361 и TB71stop. Почкование капсидов в основном наблюдалось в небольших везикулах в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A ( рис. 5 ), что согласуется с фенотипом двух укороченных на С-конце мутантов. Этот дефект вторичной оболочки был обращен вспять в ревертантном вирусе TB71revK348-351A к фенотипу родительских клеток, инфицированных вирусом TB40-BAC4 ( таблица 1 ). Это указывает на то, что мотив тетрализина ( 348 KKKK 351 ) на C-конце pUL71 необходим для эффективного вторичного покрытия ЦМВИ. ФИГ. 5 РИС. 5. Электронные микрофотографии vAC HFF, инфицированных HCMV TB71mutK348-351A, через 120 ч после заражения. Более высокие увеличения ниже показывают множество безоболочечных капсидов (белые стрелки) и одну оболочку вирусной частицы (черная стрелка). Нарушение распространения и высвобождения вируса связано с дефектом вторичной оболочки. Усечение С-конца pUL71 или мутация С-концевого тетрализинового мотива привели к явному дефекту вторичной оболочки, который был похож на дефект вируса TB71stop. Поэтому мы ожидали обнаружить аналогичный дефект роста вируса в клетках, инфицированных вирусом с мутацией С-конца, как это было описано для вируса TB71stop ( 14 ). Однако мониторинг роста вируса во время восстановления мутантных вирусов С-конца показал немного лучший рост, чем ожидалось. Для систематического решения этой проблемы мы сначала провели анализ расширения очага, чтобы сравнить клеточно-ассоциированное распространение мутантов с делецией C-конца и мутанта TB71mutK348-351A с распространением вирусов TB40-BAC4, TB71revK348-351A и TB71stop. HFF были инфицированы и культивированы в условиях наложения метилцеллюлозы в течение 9 дней. Размер отдельных очагов определялся путем подсчета числа ядер клеток, положительных по немедленному раннему белку (IE), на очаг. Как показано на рис. 6А , относительный размер фокуса обоих вирусов с усеченным С-концом, TB71del327-361 и TB71del348-361, а также тетрализинового мутанта TB71mutK348-351A, достигал около 60% от размера фокуса родительского вируса TB40-BAC4 и ревертанта TB71revK348-351A. Фокусы вирусов с мутацией С-конца были значительно больше, чем фокусы, образованные вирусом TB71stop, которые достигли только 35% от размера фокуса родительского вируса. Из этого мы сделали вывод, что отсутствие 35 и 14 С-концевых аминокислот, а также мутация С-концевого тетрализинового мотива pUL71 вызвали промежуточный фенотип распространения по сравнению с дефектом распространения вируса TB71stop. Этот распространенный дефект, скорее всего, является результатом нарушения вторичной оболочки. ФИГ. 6 ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ 🔻 |
|
Отправлено: 27 августа 2024, 19:46:40
Автор: Корнак
|
Именно так и думаю, без иронии. Ты угадал вот и зря ты так думаешь никто не помнит, чего ты тут вещал |
|
Отправлено: 27 августа 2024, 19:14:59
Автор: Печенег
|
|
А ты уже стар для таких выкрутасов и юмора, к сожалению. Пора на покой
|
|
Отправлено: 27 августа 2024, 19:12:51
Автор: Печенег
|
|
Именно так и думаю, без иронии. Ты угадал
|
|
Отправлено: 27 августа 2024, 18:56:02
Автор: Корнак
|
Так кто видящий винди или я? не понятно ты кто? думаешь пуп земли и все твои посты тут учат наизусть? |
|
Отправлено: 27 августа 2024, 18:33:21
Автор: печенег
|
|
Так кто видящий винди или я?
|
|
Отправлено: 27 августа 2024, 18:32:44
Автор: Печенег
|
|
❗️На фоне задержания Дурова разговорился Марк Цукерберг. Он заявил, что его объявленная в России террористической компания Meta (Facebook и Instagram) была вынуждена подчиниться давлению во времена Covid-19 и цензурировать контент.
«Я считаю, что давление со стороны правительства было неправильным, и сожалею, что мы не были более откровенны в этом вопросе. Я твердо убежден, что мы не должны нарушать стандарты контента из-за давления со стороны любой администрации в любом направлении - и мы готовы дать отпор, если подобное повторится», - написал Цукерберг.
Также Марк сожалеет, что скрыл контент касающийся Хантера Байдена: «С тех пор стало ясно, что репортаж не был российской дезинформацией»
Как вам такое раскаяние?Весь мир знает, что переписки в FB и WhatsApp читают ЦРУ и СБУ, благодаря этим проектам мы узнали, что такое теневой бан, понижение рейтинга и скручивание лайков.
Проверит, на сколько Цукерберг искренний, просто: напишите в fb что-нибудь разоблачающее Covid
Телеграм-канал Александр Семченко
|
|
Отправлено: 01 августа 2024, 20:23:56
Автор: Пелюлькин
|
Вот нечаянно наткнулся на удивительную публикацию, как раз на тему, как вы, наша Уважаемая Pipa , тут на этой ветке говорили про усиление патогенности SARS CoV-2 (COVID-19) при усилении основности рецептора связывания на поверхности нуклеокапсида SARS CoV-2 (COVID-19). И есть публикация именно по основам рецепторам связывания полагаемого вами катионного щипа Вириона SARS CoV-2 (COVID-19) с АНИОННЫМ рецептором. И тут публикация по этим самым АНИОННЫМ рецепторам
Сесслер Дж.Л., Гейл Ф.А., Вон-Сеоб Хо.
Химия анионных рецепторов.
Пер. с англ.: Jonathan L.Sessler, Philip A.Gale,
Won-Seob Cho. Anion Receptor Chemistry
URSS. 2011. 456 с. ISBN 978-5-396-00390-3 | Аннотация: Распознавание анионов играет определяющую роль в ряде биологических процессов. В природе обнаружены разнообразные рецепторы и переносчики. Кроме того, существует множество искусственных анионных рецепторов, полученных как по "подсказке" природы, так и благодаря интуиции химиков. В предлагаемой книге прослеживается история химии анионных рецепторов с самых ее истоков.
В книге дается общее представление о естественных анионных рецепторах и обзор современных методов химии анионных рецепторов, что позволило ясно и всесторонне изложить материал. Авторы детально рассматривают ключевые методы синтеза рецепторов, которые составляют основу для дальнейших исследований, уделяют внимание основным свойствам естественных рецепторов и транспортных систем, а также описывают область применения химии распознавания анионов.
В книге подробно освещено современное состояние химии анионных рецепторов, что заинтересует специалистов, а также дано лаконичное введение в эту область химии для начинающих исследователей. В работе отражены как специфические черты этой области супрамолекулярной химии, так и общие подходы, используемые при конструировании разных рецепторов. В книге приводится обширная библиография.
Написанная признанными специалистами, богато иллюстрированная цветными рисунками, "Химия анионных рецепторов" занимает, безусловно, достойное место среди монографий по супрамолекулярной химии.
Оригинальное издание книги вышло в серии "Монографии по супрамолекулярной химии", публикуемой Королевским химическим обществом. Целью серии является популяризация супрамолекулярной химии в научном сообществе. Работы отличает ясность изложения, их авторы являются признанными в международных научных кругах специалистами. Содержание книг отражает современный уровень развития науки. |
ОглавлениеПредисловие редактора перевода (О. И. Койфман) Предисловие к русскому изданию Предисловие Глава 1. Введение 1.1. Роль анионов в современном мире 1.2. Проблемы анионного распознавания 1.3. Анионы в биологических системах 1.4. История химии синтетических анионных рецепторов 1.5. Методы измерения: предостережения и ограничения 1.6. Заключение Литература Глава 2. Классические заряженные неметаллические системы 2.1. Полиаммониевые системы 2.1.1. Ациклические системы 2.1.2. Моноциклические системы 2.1.3. Бициклические системы 2.1.4. Полициклические системы 2.2. Четвертичные аммониевые рецепторы 2.2.1. Линейные системы 2.2.2. Моноциклические системы 2.2.3. Полициклические системы 2.3. Гуанидиниевые рецепторы 2.4. Амидиниевые рецепторы 2.5. Имидазолиевые рецепторы 2.5.1. Ациклические системы 2.5.2. Циклические системы 2.6. Тиоурониевые рецепторы 2.7. Заключение Литература Глава 3. Протонированные расширенные порфирины и их линейные аналоги 3.1. Введение 3.2. Циклические системы 3.2.1. Тетрапиррольные системы 3.2.2. Пентапиррольные системы 3.2.3. Гексапиррольные системы 3.2.4. Олигопиррольные системы 3.2.5. Рецепторы, имеющие иминные линкеры, и другие аналогичные системы 3.3. Линейные рецепторы 3.4. Заключительные замечания Литература Глава 4. Нейтральные неметаллические системы 4.1. Амидные анионные рецепторы 4.1.1. Ациклические системы 4.1.2. Циклические системы 4.1.3. Системы на основе каликсаренов и стероидов 4.2. Рецепторы на основе пептидов 4.3. Анионные рецепторы на основе мочевины 4.3.1. Ациклические системы 4.3.2. Циклические системы 4.3.3. Рецепторы на основе каликсареновых и стероидных остовов 4.4. Анионные рецепторы на основе спиртов 4.5. Гибридные рецепторы 4.5.1. Амидно-мочевинные системы 4.5.2. Мочевино-спиртовые системы 4.5.3. Спирто-амидные системы 4.5.4. Системы, содержащие амидные, гидроксильные и мочевинные фрагменты 4.6. Другие системы 4.7. Заключительные замечания Литература Глава 5. Нейтральные пиррольные системы 5.1. Введение 5.2. Циклические рецепторы 5.2.1. Системы с расширенной полостью 5.2.2. Системы высшего порядка 5.2.3. Перепоясанные системы и другие похожие рецепторы 5.3. Линейные рецепторы 5.4. Заключительные замечания Литература Глава 6. Рецепторы для ионных пар 6.1. Введение 6.2. Дитопные рецепторы 6.3. Каскадные комплексы 6.4. Рецепторы для цвиттерионов 6.5. Экстракция солей двумя рецепторами 6.6. Заключительные замечания Литература Глава 7. Металлсодержащие системы и рецепторы на основе кислот Льюиса 7.1. Рецепторы на основе кислот Льюиса 7.2. Металлы как организующие элементы 7.3. Другие рецепторы на анионы, содержащие металлы 7.4. Заключительные замечания Литература Глава 8. Сенсоры 8.1. Введение 8.2. Устройства с анион-селективными мембранами 8.3. Дискретные молекулярные электрохимические сенсоры на анионы 8.4. Дискретные молекулярные оптические сенсоры на анионы 8.5. Методы замещения 8.6. Методы, основанные на использовании процессов деагрегирования 8.7. Заключительные замечания Литература Глава 9. Контролируемая анионами сборка и темплатный синтез 9.1. Введение 9.2. Сборка, контролируемая галогенидами 9.3. Сборка, направляемая окси-анионами 9.4. Сборка, направляемая полифтор-анионами 9.5. Заключительные замечания Литература Приложение. Цветные иллюстрации (с собственной нумерацией страниц) Послесловие Список сокращений
Предисловие редактора перевода (Член-корреспондент РАН О.И.Койфман) Со времени публикации на русском языке лекций Педерсена, Крама и Лена – лауреатов Нобелевской премии 1987 г. по химии "За разработку и применение молекул со структурно специфическими взаимодействиями с высокой селективностью", положивших начало развитию супрамолекулярной химии, прошло уже более 30 лет. За это время на русском языке были изданы две важнейшие монографии: "Супрамолекулярная химия – масштабы и перспективы. Молекулы – супермолекулы – молекулярные устройства", в которой Лен изложил концептуальные проблемы супрамолекулярной химии, и "Супрамолекулярная химия" Стида и Этвуда – известных специалистов в области супрамолекулярной химии, которая по замыслу авторов является учебником и практическим руководством для большой армии практикующих и начинающих исследователей, увлеченных "химией за пределами молекул". За рубежом эта книга стала бестселлером и была переиздана в 2009 г. Представляемая читателям книга "Химия анионных рецепторов" вышла в серии "Монографии по супрамолекулярной химии", издаваемой Королевским химическим обществом, и является продолжением переводов крупных зарубежных монографий по супрамолекулярной химии на русский язык. Авторы монографии – Сесслер, профессор химии в университете Техаса в Остине (США), Гейл, профессор университета Саутгемптона (Великобритания), и Хо, доктор химии в университете Техаса в Остине (США) – являются признанными специалистами в области супрамолекулярной химии, молекулярного распознавания и определения анионов. Сесслер известен благодаря своим пионерским работам по расширенным порфиринам и их применению в биологии и медицине. Он является соучредителем компаний Pharmacyclics, Inc. и Anionics, Inc., работающих в области ионного распознавания и разработавших основы химии анионных рецепторов. Гейл является членом редакционной коллегии ряда журналов по супрамолекулярной, координационной и неорганической химии (SupraChem, Сhem. Soc. Rev., Coord. Chem. Rev., Chem. Comm.). "Химия анионных рецепторов" посвящена анионному распознаванию, которое играет ключевую роль во многих биологических процессах, а также разнообразным рецепторам и переносчикам анионов, широко распространенным в природе. Поток информации в этой бурно развивающейся области супрамолекулярной химии растет с каждым годом, требует обобщения, а в ряде случаев и переосмысления большого объема накопленных результатов на новом уровне. Монография, предлагаемая читателю, полностью решает эту проблему. Она охватывает всю литературу, начиная с пионерской работы Парка и Симмонса (которая считается отправной точкой в области нековалентной координационной химии анионов) и по существу является современной энциклопедией химии анионных рецепторов. В монографии прослеживаются истоки химии анионного распознавания как уникальной области супрамолекулярной химии, иллюстрируются основные подходы, используемые к настоящему времени в дизайне рецепторов, и приводится иерархия синтетических анионных рецепторов различных классов. В качестве существенного дополнения в монографии приведен обзор биологических рецепторных систем, который делает содержание книги более разносторонним и доступным для понимания. В частности, в монографии освещены проблемы распознавания и транспорта анионов in vivo. Данная книга представляет интерес для широкого круга ученых. Она содержит в себе, с одной стороны, краткое введение в тему для решивших заняться этой проблемой впервые, а с другой стороны – детальный обзор ключевых моментов дизайна синтетических рецепторов, представляющий существенный интерес для специалистов-практиков. Кроме того, авторы обобщили основные аспекты практического применения химии анионных рецепторов. В монографию включены главы, посвященные анионным сенсорам, анион-управляемой сборке и темплатному синтезу, в которых описаны возможные пути создания новых аналитических устройств и эффективного управления сложными химическими реакциями. Идея перевода "Anion Receptor Chemistry" возникла в результате переосмысления собственного экспериментального материала по кислотно-основной ионизации порфиринов в неводных растворах. Было замечено, что присутствие галогенидных противоионов оказывает сильное влияние на спектральную картину и численный результат кислотного титрования порфиринов, которые мы трактовали как ассоциацию противоионов в среде с невысокой диэлектрической проницаемостью. Работы, посвященные распознаванию анионов другими тетрапиррольными рецепторами, заставили нас взглянуть на полученные результаты как на селективное связывание анионов дипротонированными порфиринами, которое сопровождается четким оптическим откликом и может быть использовано для создания рН-управляемых рецепторов и переключателей-хромофоров, а также конструирования на их основе молекулярных устройств и функциональных материалов различного назначения. Это направление с 2009 г. развивается в лаборатории "Новые материалы на основе макроциклических соединений" Института химии растворов РАН (Иваново). Решение о переводе "Anion Receptor Chemistry" на русский язык было принято во время нашей встречи с Дж. Л.Сесслером на IСРР-5 (Москва, 2008 г.). Авторы русского перевода "Anion Receptor Chemistry" видят своей главной задачей сделать эту монографию доступной широкому кругу заинтересованных специалистов, аспирантов и студентов, занятых исследованиями в области супрамолекулярной химии, и просто любознательным людям, проявляющим интерес к этой достаточно новой и быстроразвивающейся области современной науки, которая открывает дверь в мир анионных сенсоров, молекулярных устройств и самособирающихся структур, подобных природным, за которой стирается грань между рукотворным и живым. Мы выражаем благодарность Джонатану Сесслеру, Эйвери Эйтен и Екатерине Ратковой за конструктивное сотрудничество в работе над переводом и изданием "Химии анионных рецепторов". Член-корреспондент РАН О.И.Койфман
Предисловие к русскому изданию Прежде всего хотелось бы поблагодарить наших российских коллег, взявших на себя труд перевести книгу "Химия анионных рецепторов". Оригинальный английский вариант был опубликован в 2006 г. в серии монографий по супрамолекулярной химии, редактируемой профессором сэром Фрейзером Стоддартом. В русском варианте исправлены обнаруженные ошибки и опечатки, однако новый материал в книгу не добавлялся. Поскольку в последние 3–4 года число публикаций по химии анионных рецепторов существенно возросло, анализ только самых важных результатов значительно увеличил бы объем книги. Заинтересованный читатель может получить представление о последних достижениях в этой области химии в обзорах, опубликованных в журнале Chem. Soc. Rev. (2008. 37. 151–190; 2009. 38. 520–563; 2009. 38. 1572–1586; 2009. 38. 1647–1662). Среди ставших уже классическими направлений, особенно интенсивно развивавшихся в последние годы и детально описанных в нашей книге, следует упомянуть использование в процессах распознавания анионов NH-доноров водородной связи (а также рецепторов, содержащих индол) и льюисовских кислотных центров. Описан целый ряд рецепторов и сенсоров, содержащих эти фрагменты. Опубликовано много работ, в которых авторы исследуют анион-р взаимодействия и свойства CH-доноров на основе имидазолиевых катионов и 1,2,3-триазолов. В последние два года выделилась новая, неизвестная в 2006 г., группа индикаторов на анионы, в которых используются необратимые химические реакции ("reaction-based indicators"). Новым является использование анионов для контроля конформационных движений в комплексных рецепторных системах и стабилизации интеркаляционных структур, таких как катенаны и ротаксаны. Следует отметить также развитие химии экстрагентов малых ионов и полимеров с инкорпорированными рецепторами на анионы. Отдельного упоминания заслуживают исследования лекарств, действие которых основано на процессах распознавания анионов, включая синтез переносчиков и каналов, регулирующих трансмембранный перенос анионов. Результаты, полученные в последние годы, открыли новые направления в химии распознавания анионов. Мы надеемся, что перевод нашей книги на русский язык поможет российским ученым внести свой вклад в эту интереснейшую область науки. Дж. Л.Сесслер, Ф.А.Гэйл, Вон-Сеоб Хо Предисловие Супрамолекулярная химия, к которой читатели этой книги, как надеются авторы, относятся с энтузиазмом, открывает завораживающий и необозримый мир молекулярных взаимодействий, простирающийся за пределами простых ковалентных связей. Выяснение природы этих взаимодействий и исследование их новыми методами определяет сущность супрамолекулярной химии. Проблемы и возможности этой области науки привлекают все большее число исследователей, что отражается в близком к экспоненциальному росте публикаций. Особенно это касается важной части супрамолекулярной химии – распознавания анионов. Развитие этой области химии определяется прежде всего осознанием роли, которую играют нековалентные анион-молекулярные взаимодействия в биологии, физиологии, медицине, синтетической химии, при конструировании новых материалов, сенсоров, переработке отходов. Значительный прогресс достигнут в понимании основных принципов, управляющих процессами распознавания анионов. Это приводит к тому, что уже не только эстетические соображения, но и возможные практические приложения начинают определять развитие данной области науки. Цель монографии – дать читателю представление об основных разделах супрамолекулярной химии анионов с акцентом на проблеме дизайна синтетических анионных рецепторов и перспективах их практического применения. Книга разделена на восемь основных глав, каждая из которых посвящена какой-либо важной проблеме и является обобщением имеющихся литературных данных. Основным главам предшествует вводная глава, написанная в более доступной форме и показывающая важность анионов в повседневной жизни и биологии. Частью этой главы является исторический экскурс. Авторы будут считать свою задачу выполненной, если заинтересованный читатель получит представление о прошлом, настоящем и перспективах на будущее рассматриваемой области науки, ее основных идеях и принципах, лежащих в основе сконструированных человеком и природой "миров анионного распознавания". Авторы благодарны фондам и агентствам, финансовая поддержка которых сделала возможным появление этой книги и выполнение связанных с ее темой научных проектов, особенно Национальным институтам здоровья и Министерству энергетики (гранты GM 58907 и DE-FG02–04ER63741, полученные Д.Л.Сесслером); Ф.А.Гэйл благодарит Королевское общество за предоставленный грант для исследований, Научный совет по инженерным и физическим наукам (EPSRC) за финансовую поддержку, а также Королевское химическое общество за грант международных журналов. Дж. Л.Сесслер, Ф.А.Гэйл, Вон-Сеоб Хо
Об авторах  | Джонатан Л. СЕССЛЕР -- Профессор Техасского университета в Остине. В 1977 г. получил степень бакалавра химии в университете Беркли (Калифорния), в 1982 г. – докторскую степень в области органической химии в Стэнфордском университете (руководитель – проф. Дж. П. Коллман). После защиты диссертации работал в университете Луи Пастера, также известном как Страсбург I (лаборатория лауреата Нобелевской премии проф. Ж.-М. Лена) и приглашенным ученым-исследователем в университете Киото (лаборатория проф. Табуши). С 1984 г. по настоящее время работает в Техасском университете; с 1992 г. – полный профессор университета. Автор 300 публикаций, в том числе нескольких книг; обладатель более 70 патентов. Член редакций нескольких международных журналов. Основатель компании Pharmacyclics, Inc. (совместно с Р. А. Миллером), занимающейся использованием расширенных порфиринов в медицине, и компании Anionics, Inc. (совместно с М. Р. Джонсоном), специализирующейся на различных коммерческих приложениях исследований анионов. Награжден рядом престижных премий, в том числе премией Американской ассоциации развития науки. |
 | Филипп А. ГЭЙЛ -- Профессор университета Саутгемптона. В 1992 г. получил степень бакалавра в Оксфордском университете, в 1995 г. там же – докторскую степень (руководитель – проф. П. Беер). Затем работал в Техасском университете, в лаборатории проф. Дж. Л. Сесслера. В 1997 г. получил исследовательскую стипендию Королевского общества и вернулся в Оксфордский университет. С 1999 г. по настоящее время работает в университете Саутгемптона. Автор более 160 публикаций, в том числе двух книг и нескольких обзоров по супрамолекулярной химии. Член редакционных коллегий ряда международных журналов. |
 | Вон-Сеоб Хо -- В 1996 г. получил степень бакалавра, в 2000 г. – степень магистра в Кангвонском национальном университете. Затем работал в Техасском университете, в лаборатории проф. Дж. Л. Сесслера, где в 2005 г. ему была присвоена степень доктора. После защиты диссертации работал в Калифорнийском университете (Лос-Анджелес), затем вернулся в Южную Корею. В настоящее время занимается исследованиями углеродных волокон в компании HyoSung Corp. |
|
|
Отправлено: 05 июня 2024, 19:31:08
Автор: Нагвалист
|
|
Британский Telegraph: Ученые предполагают, что вакцины от Covid могут быть причиной роста избыточной смертности после пандемии.
Исследователи из Нидерландов проанализировали данные из 47 западных стран и обнаружили, что с 2020 года произошло более трех миллионов дополнительных смертей, причем эта тенденция сохраняется, несмотря на внедрение вакцин и меры сдерживания.
Они заявили, что «беспрецедентные» цифры «вызывают серьезную обеспокоенность», и призвали правительства полностью расследовать основные причины, включая возможный вред вакцин.
Не плохо так, 3 миллиона человек умертвили чудо укольчиками и люди продолжают дохнуть как мухи...
|
|
Отправлено: 16 мая 2024, 11:07:01
Автор: Корнак
|
Дискредитация и снижение доверия к фармацевтической промышленности. вот это очень примечательный пункт дело в том, что практически вся остальная фарма нисколько не лучше этой вакцины и эта попытка отторгнуть от себя совсем уж обосравшихся - всего лишь желание сбросить груз с падающего воздушного шара, накаченного враньем и деньгами |
|
Отправлено: 16 мая 2024, 10:47:51
Автор: печенег
|
Файзер тоже сожалеет вслед на астразенакой. https://www.enstarz.com/articles/233599/20240513/pfizer-re-deeply-sorry-misleadingly-illegally-promoting-vaccine.htmPfizer заявляет, что «глубоко сожалеет» о нарушении 5 пунктов нормативного кодекса и незаконном продвижении своей вакцины от Covid. Ну, всё, расходимся. Файзер извинился 😂 Что же такого там нарушил Файзер (кроме подкупа должностных лиц нескольких десятков стран с тем, чтобы их ширялово принудительно впаривали людям) ? Пункт 2. Дискредитация и снижение доверия к фармацевтической промышленности. Пункт 3.1. Продвижение нелицензированного медицинского препарата (где сейчас те фактчекеры с «у файзера есть лицензия!» ?) Пункт 7.2. Заявление, вводящее в заблуждение (это, если кто не понял, про эффективность и безопасность 😉) Пункт 7.9. Заявления, не отражающие имеющиеся данные о возможных побочных реакциях (и это тоже про безопасность) Пункт 91 Неспособность поддерживать высокие стандарты (а это про полное отсутствие совести всех причастных). Представители Файзера с честными глазами сказали, что их твиты про 95% эффективность и безопасность «были случайными и ненамеренными»… «Простите, дяденька, я случайно. Я не хотел. Я больше так не буду» — вы прослушали компенсацию от Файзера жертвам вакцинации в полном объеме. @being_human_rus ps: еще раз удалите мои сообщения, будете сами воевать против азова и кракенов бл*, диванные модеры |
|
Отправлено: 26 апреля 2024, 13:35:22
Автор: джелави
|
как и бесы ненавидят Бога, Ангелов да и самих всех 100% людей... тогда смерть от прививки приравнивается к суициду. Самоубийство - тяжкий грех, потому перед вакцинацией они брали подпись на согласие, человек вакцинированный соглашался на самоубийство! по этой же причине паразиты во власти протаскивают в странах эвтаназию, ИМ нужны грешные души! Такой вердикт вынес немецкий суд: поскольку безвредность прививки от СOVID-19 не доказана, добровольное принятие смертельного риска юридически признается самоубийством.то ли ещё будет Познакомьтесь со своим новым врачом — Гебрейесусом у него НУЛЕВАЯ медицинская квалификация, но он собирается стать защитником вашего здоровья Он бывший министр здравоохранения Эфиопии, скрывал 3 эпидемии холеры и был выбран правительством Китая и США для руководства ВОЗ Во время COVID-19 Его советы оказались катастрофическими! Администрация Байдена тайно работает над тем, чтобы дать ему полномочия: — объявлять ЧС в области общественного здравоохранения, не основываясь ни на каких критериях. — заставлять вас получать непроверенные экспериментальные вакцины, которые предоставляются без какой-либо ответственности. Весь риск за вами, прибыль - за фармацевтической компанией, — Подвергать цензуре высказывания, которые не соответствуют требованиям ВОЗ. — Устраивать карантины. — Отдавать приказы 196 странам о том, как они должны управлять общественным здравоохранением. — Требовать, чтобы страны платили за его программу по биобезопасности. и хорошая новость: По Японии прошли масштабные протесты. Сотни тысяч человек вышли на улицы, чтобы высказаться против присоединения страны к глобальному соглашению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по борьбе с пандемией. По мнению митингующих, это посягательство на суверенитет Японии, ведь ВОЗ, например, может ввести обязательную вакцинацию. Похоже, японцы не хотят, чтобы неизбранные психотические глобалисты требовали введения вакцин, масок и локдаунов.. подробнее |
|
Отправлено: 26 апреля 2024, 12:58:02
Автор: печенег
|
|
решил довести дело до конца, на сво уже 7 месяц штурмую биолабы западников
|
|
Отправлено: 26 апреля 2024, 12:56:40
Автор: печенег
|
|
Из серии «мелочь, а приятно».
“Урсула фон дер Ляйен и Альбер Бурла (Pfizer) предстанут перед судом первой инстанции города Льежа 17 мая 2024
по делу об уничтожении административных документов, коррупции и незаконном получении процентов от закупки вакцин против Covid-19 на сумму 35 миллиардов евро.” - сообщает Флориан Филиппо, французский оппозиционер и один из истцов по этому делу, в своем аккаунте Х.
Особенных иллюзий на счет потенциального наказания Урсулы и Бурлы я не питаю.
Но сама мысль о том, что эти двое должны будут оправдываться перед судом, немного греет душу.
@being_human_rus
|
|
