ПРОДОЛЖЕНИЕ 🔻
➤➤ РИС. 6 Рост мутантов C-конца pUL71. (A) Анализ расширения фокуса указанных вирусов в HFF под слоем метилцеллюлозы. Клетки, инфицированные ЦМВИ, были обнаружены с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания на антиген IE1/2 через 9 дней после заражения (dpi). Каждая точка данных представляет собой относительное количество IE1/2-положительных ядер на фокус. Показан средний размер фокуса для каждого вируса (черная линия), нормализованный по среднему размеру фокуса TB40-BAC4. Для каждого вируса было определено не менее 80 фокусов из трех независимых экспериментов. Проверка значимости проводилась с помощью теста Краскела-Уоллиса, за которым следовал тест множественного сравнения Данна ( P < 0,05). Значимость дана по сравнению с TB40-BAC4 и TB71stop. ***, P < 0,0001; ns, незначимо. (B) Многоступенчатые эксперименты по кинетике роста указанных вирусов проводились путем инфицирования HFF с уровнем инфицирования 0,3%. Выходы вируса в супернатантах инфицированных клеток определялись в указанные моменты времени путем титрования на HFF. Кривые роста показывают средние выходы вируса и стандартные отклонения от трех независимых вирусных супернатантов. Выходы вируса в нулевой момент времени представляют собой начальные уровни инфицирования, определенные через 24 часа после заражения. (C) Одноступенчатые эксперименты по кинетике роста указанных вирусов проводились на HFF с MOI 3. Выходы вируса в супернатантах инфицированных клеток определялись в указанные моменты времени путем титрования на HFF. Кривые роста показывают средние выходы вируса и стандартные отклонения от трех независимых вирусных супернатантов. Выходы вируса в нулевой момент времени представляют собой выходы вируса инокулята.
Затем производство и высвобождение инфекционности вирусов с мутацией на С-конце оценивали с помощью многоступенчатой кинетики роста по сравнению с родительским вирусом. Как показано на рис. 6B , выход внеклеточного вируса TB71del327-361, TB71del348-361 и TB71mutK348-351A был снижен в 20 раз по сравнению с выходом вируса TB40-BAC4 и TB71revK348-351A, тогда как вирус TB71stop показал 5000-кратное снижение выхода внеклеточного вируса через 12 дней после заражения.
В совокупности промежуточный рост вирусов с мутацией на С-конце и более серьезный дефект роста вируса TB71stop указывают на то, что pUL71 обладает дополнительными функциями, способствующими росту вируса, которые отделены от регуляции вторичной оболочки С-концом pUL71.
Теперь возник вопрос, является ли только дефект распространения причиной нарушения роста в эксперименте по многоступенчатой кинетике роста или же на высвобождение вируса также влияет делеция С-конца или мутация мотива тетрализина. Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели эксперимент по одноступенчатой кинетике роста. Поскольку два мутанта делеции вели себя одинаково в предыдущих экспериментах, мы сравнили выход внеклеточного вируса только TB71del348-361 с TB71mutK348-351A, TB40-BAC4 и TB71revK348-351A ( рис. 6C ). Родительские и ревертантные вирусы достигли своего максимального выхода вируса на 7-й день после заражения. В то время оба мутанта показали небольшое снижение выхода внеклеточного вируса примерно в 1,5 раза. Максимальное снижение урожайности вируса TB71mutK348-351A по сравнению с TB40-BAC4 составило примерно 10 раз через 3 дня после заражения. Таким образом, мы предположили, что дефект вторичной оболочки влияет не только на распространение вируса, но и на высвобождение вируса в незначительной степени. Однако мутация мотива тетрализина C-конца в pUL71 повлияла на выход потомства вируса в удивительно малой степени, учитывая глубокое нарушение вторичной оболочки.
Трехмерная визуализация тегументации и вторичной оболочки.
Наконец, мы попытались исследовать стадии вторичной оболочки с помощью трехмерной электронной микроскопии, чтобы получить больше информации о ее механизме. Вторичная оболочка не очень часто наблюдается в клетках, инфицированных вирусом дикого типа. Чтобы проанализировать достаточное количество различных стадий, мы использовали мутантный вирус TB71mutK348-351A, который демонстрирует морфологически неотличимую вторичную оболочку от вируса дикого типа (почкование отдельных капсидов в небольшие пузырьки) с преимуществом возможности наблюдать увеличенное количество цитоплазматических капсидов, подвергающихся вторичной оболочке. Шестьдесят два капсида на разных стадиях вторичной оболочки были проанализированы из 11 томограмм клеток, инфицированных TB71mutK348-351A, тогда как только 5 почковавшихся капсидов были обнаружены в 8 томограммах клеток, инфицированных вирусом дикого типа. Как показано на рис. 7А , обертывание начинается с капсидов, которые уже украшены электронно-плотным материалом, который, скорее всего, образован белками тегумента. Этот удивительно регулярно расположенный материал выступает из капсидов и контактирует с мембраной. Когда мембрана оборачивается вокруг капсида, этот материал, по-видимому, сохраняет определенное срединное расстояние (приблизительно 36 нм) до мембраны ( рис. 7Б ). Это расстояние в почкующихся капсидах TB71mutK348-351A похоже на то, что измеряется в почкующихся капсидах вируса дикого типа, а также похоже на срединное расстояние во внутриклеточных обернутых капсидах мутанта, а также вируса дикого типа ( рис. 7Б ).
ФИГ 7
РИС. 7 Стадии вторичной оболочки ЦМВИ. (A) Капсиды вируса TB71mutK348-351A на разных стадиях вторичной оболочки на основе трехмерной STEM-томографии........
(B) Расстояние между контуром ядра ДНК и обертывающей мембраной (зеленая линия на изображении A1) почковавшихся и обернутых капсидов измерялось на томограммах клеток, инфицированных TB71mutK348-351A и TB40-BAC4. .............
В отличие от тегумента капсидов на начальной стадии обертывания, тегумент во внутриклеточных оболочечных вирионах мутантных и диких вирусов выглядит как однородный электронно-плотный слой без четких структур. Многочисленные стадии обертывания капсидов были зарегистрированы из клеток, инфицированных мутантным вирусом. Интересно отметить, что формирование однородного тегумента, по-видимому, начинается с одной стороны почкующегося капсида. Капсиды на продвинутых стадиях обертывания мембраной, определяемые меньшим расстоянием между двумя плечами обертывающей везикулы, обычно демонстрируют более крупные участки однородного тегумента, что позволяет предположить, что тегумент формируется вместе с процессом вторичного обертывания. Вторичное обертывание завершается событием разрыва мембраны, которое требует предварительного образования узкой шейки почки. Многочисленные капсиды были обнаружены на стадии, когда два плеча обертывающей мембраны были разделены лишь небольшим зазором в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A. Количественный анализ трехмерных данных этих вирусных частиц выявил образование узкой шейки почки на этих везикулах с минимальной наблюдаемой шириной шейки 9,1 нм ( рис. 7C ).
Далее мы исследовали, оказывает ли мутация C-конца в pUL71 неблагоприятное воздействие на определенную стадию вторичной оболочки, что привело бы к накоплению капсидов на этой конкретной стадии. Стадии вторичной оболочки были определены на основе расстояния между двумя плечами обертывающей везикулы. На STEM-томограммах это расстояние варьировалось от 9,1 нм (шейка почки) ( рис. 7A , капсид 4) до 206,9 нм (везикула в форме полумесяца) ( рис. 7A , капсид 1). Не было никакого явного накопления капсидов на определенном расстоянии, что позволяет предположить, что мотив тетрализина pUL71 не участвует в определенной стадии вторичной оболочки ( рис. 7C ). Расстояние d в нескольких наблюдаемых почковавшихся капсидах дикого типа было распределено в том же диапазоне, что и в мутантном вирусе.
Еще одним интересным наблюдением в томограммах STEM было то, что многие капсиды отпочковывались в везикулы, которые были не просто сферическими, а демонстрировали более сложные формы, часто с трубчатыми расширениями ( рис. 8 и см. также фильм S1 в дополнительном материале). Эти дополнительные трехмерные мембранные особенности обычно не видны на двумерных микрофотографиях, которые получаются из ультратонких срезов. Из-за толщины среза всего 70 нм ультратонкие срезы содержат только небольшую часть этих везикул. Таким образом, в двумерных поперечных сечениях часто оказывается, что капсиды отпочковываются в небольшие сферические везикулы (профиль в форме полумесяца в двух измерениях), которые, по-видимому, не обеспечивают достаточно мембраны для завершения обертывания.
ФИГ 8
РИС. 8. Формирование шейки почки (белые наконечники стрелок).
Подводя итог, можно сказать, что подробный анализ вторичной оболочки ЦМВИ в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, позволяет предположить скоординированный процесс, посредством которого слой тегумента формируется во время процесса вторичной оболочки, который завершается узкой шейкой почки, имеющей критическую ширину до события разделения.
ОБСУЖДЕНИЕ
Механизм вторичной оболочки HCMV в настоящее время не изучен. Одним из немногих вирусных белков, которые, как известно, модулируют этот процесс, является pUL71. Интересно отметить, что pUL71 высококонсервативен среди своих гомологов герпесвирусов и, по-видимому, имеет схожие функции, такие как участие во вторичной оболочке ( 14 , 23 , 24 , 27 ). HCMV pUL71 является одним из самых больших белков среди своих гомологов, тогда как его C-конец является наименее консервативной частью. Здесь мы обнаружили, что C-конец pUL71, в частности мотив тетрализина, необходим для эффективной вторичной оболочки HCMV. Это добавляет еще одну важную функциональную область к уже идентифицированным мотивам в N-конце pUL71. Наши новые результаты подчеркивают роль pUL71 в процессе, лежащем в основе почкования капсидов на мембранах, непосредственно перед финальным событием разрыва мембраны, необходимым для завершения вторичной оболочки ЦМВИ.
Ультраструктурный анализ выявил функцию С-конца pUL71 во вторичной оболочке.
Идентификация мотива тетрализина для вторичной оболочки основывалась, как и в предыдущих анализах мутантных вирусов pUL71, на подробном количественном анализе ТЭМ инфицированных вирусом HFF на поздних стадиях инфекции. Исключительная структурная сохранность биологических мембран с использованием замораживания под высоким давлением и замены замораживания для подготовки образцов ЭМ позволила нам различить и количественно оценить различные стадии созревания, которые проходят цитоплазматические капсиды для получения своей оболочки. Обработка образцов, получение изображений и количественная оценка стадий оболочки в этом исследовании проводились точно так же, как и для других мутантных вирусов pUL71 ( 14 , 26 ), что оправдывает сравнение результатов этого исследования с предыдущими количественными оценками. Кроме того, мы включили хорошо охарактеризованный мутантный вирус с дефицитом UL71, TB71stop, в это исследование для прямого сравнения. В то время как нарушение вторичной оболочки мутантов с делецией С-конца, а также мутанта тетрализина похоже на дефект, количественно определенный при инфекциях TB71stop, другие ультраструктурные характеристики вирусов-мутантов UL71 не были обнаружены, включая увеличенные MVB, почкование многочисленных капсидов в MVB и множественные события почкования капсидов в расширенных мембранных компартментах ( 14 , 25 , 26 ). Это приводит к двум основным выводам. Во-первых, мотив тетрализина С-конца играет роль во вторичной оболочке HCMV, не оказывая видимого влияния на морфологию MVB и других мембран vAC. Таким образом, кажется, что C-конец pUL71 механически участвует в процессе вторичной оболочки. Во-вторых, pUL71 несет в себе дополнительные функции, помимо модуляции вторичной оболочки, которые связаны с организацией мембран vAC и измененной морфологией MVB. Насколько нам известно, эти дополнительные функции pUL71 связаны с мотивом, похожим на лейциновую молнию, участвующим в олигомеризации pUL71 ( 26 ), и мотивом трафика на основе тирозина, регулирующим накопление pUL71 в vAC ( 25 ).
Вклад мотива тетрализина pUL71 во вторичную оболочку.
Один все еще неотвеченный, но важный вопрос заключается в том, как C-конец и мотив тетрализина способствуют вторичному обертыванию. Из-за отсутствия надежных структурных данных для pUL71 мы можем только предполагать. Однако мы можем исключить, что измененная внутриклеточная локализация pUL71 объясняет нарушение вторичного обертывания при мутации мотива тетрализина ( рис. 4 и 5 ; таблица 1 ). Мы также можем исключить, что немного более низкие уровни белка pUL71 в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, являются причиной из-за неизмененных уровней pUL71 и похожего фенотипа мутантов с укороченным C-концом ( рис. 2A , 3 и 6 ). Механистически pUL71 может выполнять свою роль во вторичном обертывании только тогда, когда он способен ассоциироваться с мембранами в vAC. Недавно было показано, что pUL71 локализуется на цитоплазматической поверхности мембран Гольджи ( 25 ). Поскольку pUL71 не имеет трансмембранного домена, ему требуются средства для связи с мембранами. Лизин является положительно заряженной полярной аминокислотой. При мутации мотива тетрализина положительно заряженные полярные остатки лизина были заменены незаряженными неполярными остатками аланина. Имеются убедительные доказательства того, что положительно заряженные аминокислоты могут напрямую взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами мембраны, такими как фосфолипиды ( 40–43 ). Интересно, что несколько известных доменов связывания липидов, включая домены PH и FYVE, доминируют положительно заряженные аминокислоты, что подтверждает идею о том, что лизин и аргинин взаимодействуют с липидами ( 41 ). Таким образом, C-конец pUL71 может быть вовлечен во взаимодействие с липидами и тем самым способствовать вторичному обертыванию. Эту гипотезу трудно проверить, поскольку мембранное взаимодействие положительно заряженных аминокислот в основном временное и облегчается электростатическим взаимодействием с липидами. Наши данные, показывающие, что мутация мотива тетрализина в незаряженные аланины не оказывает обнаруживаемого эффекта на внутриклеточную локализацию pUL71 и его локализацию на golgin-97-положительных мембранах в vAC, предполагают, что мембранная ассоциация и транспортировка pUL71 не обнаруживаются нарушенными. Это, возможно, неудивительно, учитывая, что pUL71, вероятно, пальмитоилирован по консервативным остаткам цистеина N-конца, подобно его гомологу pUL51 в HSV-1, и что пальмитоилирование облегчает мембранную ассоциацию pUL51 ( 33 ). Белки, которые участвуют в процессе деформации мембраны, таком как обертывание вирусных мембран, часто требуют множественных мембранных взаимодействий ( 44). Следовательно, можно предположить, что мотив тетрализина может, хотя и не требуется для ассоциации pUL71 с мембранами, взаимодействовать с мембраной и выравнивать белок таким образом, что позволяет pUL71 функционировать при деформации и разрыве мембраны. Индукция кривизны мембраны очень важна для процесса вторичного обертывания, поскольку она облегчает поглощение капсида клеточными мембранами. Постулируются три взаимоисключающих способа, с помощью которых белки могут индуцировать кривизну мембраны: (i) механизм скаффолда, (ii) механизм локальной спонтанной кривизны и (iii) механизм двухслойной пары (рассмотренный в ссылке 45 ). Было бы интересно исследовать, использует ли pUL71 какой-либо из этих механизмов для поддержки вторичного обертывания.
Также возможно, что мутация тетрализинового мотива изменяет сворачивание белка. В этом контексте положительно заряженные аминокислоты стабилизируют сворачивание белка путем взаимодействия с отрицательно заряженными областями. В настоящее время нам неизвестно, присутствует ли С-концевой тетрализиновый мотив на поверхности или скрыт в контексте свернутого белка.
В качестве альтернативы, C-конец может быть вовлечен во взаимодействие с клеточными или вирусными белками, чтобы либо рекрутировать эти белки в vAC, либо сформировать функциональный белковый комплекс. Потенциальными партнерами взаимодействия pUL71, которые были обнаружены при скрининге дрожжей и гибридов, являются UL24, UL26, UL89.2 и UL51 ( 46 ). Однако единственное подтвержденное взаимодействие с pUL71 — это взаимодействие с pUL103 ( 47 , 48 ). Точная роль белкового комплекса для морфогенеза вируса в настоящее время изучается.
Другим функциональным аспектом положительно заряженных аминокислотных мотивов для ядерного импорта является их функция в качестве сигналов ядерной локализации (NLS) ( 49 , 50 ). Например, NLS большого Т-антигена вируса обезьян 40 состоит из одного кластера аминокислот PKKKRKV ( 51 , 52 ). Несмотря на отсутствие экспериментальных доказательств, мы считаем маловероятным, что мотив тетрализина функционирует как NLS, поскольку ядерная локализация pUL71 не была обнаружена ни при транзиторной экспрессии ( 25 ), ни при инфекции ( 27 , эта статья). Кроме того, трудно представить, как ядерная локализация pUL71 будет способствовать вторичному обертыванию HCMV.
Таким образом, точная функция или вклад мотива тетрализина в процесс вторичной оболочки остается неясным. Было бы очень интересно решить структуру pUL71 в будущих исследованиях, что могло бы помочь прояснить, как C-конец способствует вторичной оболочке ЦМВИ.
Влияние нарушения вторичной оболочки на рост вируса.
Генерация мутантных вирусов с дефектом вторичной оболочки без влияния на морфологию MVB и других мембран vAC позволила нам определить влияние этого дефекта на распространение и высвобождение вируса. Мутанты с делецией C-конца и мутант тетрализина продемонстрировали нарушение клеточно-ассоциированного распространения и снижение выхода внеклеточного вируса в экспериментах по многоступенчатой кинетике роста, что согласуется с тем, что можно было бы ожидать, когда образуется меньше внутриклеточных частиц с оболочкой ( рис. 6A и B ). Примечательно, что клеточно-ассоциированный рост и высвобождение инфекционности были менее серьезно нарушены у вирусов с мутантами C-конца, чем у мутантного вируса, который не способен экспрессировать pUL71, несмотря на сопоставимое нарушение вторичной оболочки ( таблица 1 и рис. 6A и B ). Более того, 5-кратное уменьшение количества обернутых капсидов в vAC в мутантах pUL71 с С-концевой локализацией привело к уменьшению титров внеклеточного вируса в одношаговой кинетике роста всего в 1,5 раза ( рис. 6C ). Это говорит о том, что вторичное обертывание не является этапом, определяющим скорость высвобождения инфекционных вирусных частиц. Это согласуется с нашим предыдущим трехмерным ультраструктурным исследованием, показывающим, что общее количество обернутых капсидов в одном vAC значительно превышает количество инфекционных вирионов, высвобождаемых из инфицированной клетки ( 3 , 53 ).
Учитывая ультраструктурные изменения в клетках, инфицированных вирусом TB71stop, структура и/или происхождение мембран и везикул, в которых происходит вторичная оболочка, также имеют большое значение для эффективности роста вируса и, по-видимому, по крайней мере частично контролируются pUL71.
Электронно-микроскопический анализ морфогенеза вируса показывает ультраструктуру инфицированных клеток в данный момент времени. Обнаружение частиц вируса в оболочке в vAC и инфекционного вируса в супернатантах указывает на то, что генерация зрелых вирусных частиц не полностью блокируется в клетках, инфицированных вирусом-мутантом UL71. Однако вторичная оболочка, по-видимому, затруднена, на что указывает накопление капсидов в процессе вторичной оболочки у исследованных мутантов UL71.
Трехмерная визуализация почкующихся капсидов позволяет лучше понять тегументацию и вторичную оболочку.
Повышенное количество капсидов, подвергающихся обертыванию в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, и схожая морфология этого процесса по сравнению с таковой при заражении вирусом дикого типа позволили нам более подробно изучить различные стадии вторичного обертывания с помощью трехмерной электронной микроскопии.
Начало оболочки, по-видимому, не затронуто в мутантных вирусах UL71, поскольку подавляющее большинство капсидов, находящихся в тесном контакте с мембранами, по крайней мере частично окутаны ими. STEM-томография отдельных капсидов на разных стадиях созревания показала, что формирование тегумента происходит по мере прогрессирования оболочки. Мы хотим подчеркнуть, что большая часть этих данных получена из клеток, инфицированных TB71mutK348-351A, и поэтому их следует тщательно интерпретировать относительно стадий оболочки в клетках, инфицированных вирусом дикого типа. Однако мы обнаруживаем похожие стадии в клетках, инфицированных диким типом, хотя и с гораздо меньшей частотой ( таблица 1 и рис. 7B и C ). Такое же исследование в клетках, инфицированных диким типом, потребовало бы от нас получения примерно в десять раз большего количества томограмм, чтобы достичь достаточного количества почковавшихся капсидов для количественного анализа.
Со всей должной осторожностью мы постулируем модель формирования тегумента, в которой большинство белков тегумента уже связано с капсидом или мембраной на этапе инициации оболочки ( 16 ) и в которой их концентрация посредством белок-белковых взаимодействий и дальнейших этапов созревания (например, посттрансляционных модификаций) приводит к ультраструктурно однородному слою тегумента. Это представление подтверждается многочисленными данными, сообщающими о накоплении белков тегумента в vAC ( 16 , 19 , 25 ), и согласуется с современной моделью тегументации ( 54–57 ) .
Показав, что толщина слоя тегумента была одинаковой у почковавшихся и внутриклеточных обернутых частиц, у нас есть основания полагать, что толщина слоя тегумента полностью устанавливается в начале вторичного обертывания. Регулярно расположенный материал тегумента вокруг капсида, который также наблюдался с помощью STEM-томографии капсидов дикого типа ( 3 ), скорее всего, служит в качестве каркаса для формирующегося тегумента.
Процесс обертывания завершается образованием узкой шейки почки с минимальным расстоянием между мембранами 9,1 нм. Эта шейка почки выглядит как небольшое отверстие в мембране обертывающего пузырька в трех измерениях. Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий образование узкой шейки почки во вторичной оболочке герпесвируса с использованием трехмерной электронной микроскопии. По крайней мере, в клетках, инфицированных TB71mutK348-351A, и нескольких капсидах дикого типа не было заметно явного накопления белка в шейке почки. Это контрастирует с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) ( 58 ), где зазор между противоположными мембранами заполнен электронными плотностями, происходящими из клеточных белков, связанных с комплексом сортировки эндосом, необходимым для событий разрыва мембраны, опосредованных транспортом (ESCRT). Однако это следует интерпретировать с осторожностью, поскольку наш метод подготовки отличается от метода, который использовался для изучения ВИЧ-инфекции. Тем не менее, до сих пор неясно, как происходит расщепление мембраны при инфекции ЦМВИ. Отсутствие электронно-плотного материала в шейке почки подтверждает недавно опубликованные данные о том, что механизм ESCRT не требуется для этого процесса при ЦМВИ ( 59 ). Таким образом, можно предположить, что расщепление при инфекции ЦМВИ может быть опосредовано действием вирусных белков, например, pUL71, или с помощью других клеточных белков, которые еще предстоит идентифицировать. Раскрытие механизма вторичной оболочки, безусловно, потребует гораздо больше работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки.
Фибробласты крайней плоти человека (HFF) поддерживались в минимальной необходимой среде (MEM; Gibco-BRL) и использовались до пассажа 23. Фибробласты легких эмбриона человека (MRC-5; Европейская коллекция клеточных культур) поддерживались в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Gibco-BRL) и использовались между пассажами 21 и 30 для восстановления вируса. Как MEM, так и DMEM были дополнены 2 мМ l -глутамином (200 мМ; PAA Laboratories), 10% сыворотки плода теленка, 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина (все три от Gibco-BRL) и 1× заменимыми аминокислотами (Biochrom AG).
Генерация мутантных вирусов.
Родительский вирус всех рекомбинантных вирусов этого исследования был воссоздан из клона бактериальной искусственной хромосомы ЦМВИ TB40-BAC4, полученного из эндотелиотропного штамма ЦМВИ TB/40E (номер доступа EF999921.1 [ 35 ]). Рекомбинантные вирусы были получены с использованием безмаркерной двухэтапной рекомбинации RED-GAM, как описано ранее ( 60 , 61 ).
В этом методе рекомбинации используются праймеры, которые содержат гомологию с последовательностью UL71 выше и ниже последовательности, подлежащей мутации, а также гомологию с плазмидой-шаблоном pEPkan-S ( 60 ).
......... Секвенирование мутировавших участков подтвердило правильность введения мутаций. Бакмиды рекомбинантных вирусов ЦМВИ были воссозданы в MRC-5, как описано ранее ( 62 , 63 ). Затем HFF использовались для дальнейшего размножения вируса и генерации вирусных запасов. Генерация вируса с дефицитом UL71 (TB71stop) описана в другом месте ( 14 ).
Антитела.
HCMV и клеточные белки были обнаружены с помощью моноклональных антител (MAb) в непрямых иммунофлуоресцентных окрашиваниях, вестерн-блот-анализах, анализах расширения фокуса и титрованиях вируса. Мышиные MAb были направлены против HCMV IE1/2 (MAb 63-27), главного капсидного белка HCMV (MCP; MAb 28-4), pp65 (pUL83; MAb 65-33, любезно предоставленного W. Britt, Университет Алабамы, Бирмингем), pp28 (клон 5C3; Santa Cruz Biotechnology), клеточного golgin-97 (IgG1; Invitrogen) и клеточного актина (Sigma). HCMV pUL71 был обнаружен в экспериментах по непрямой иммунофлуоресценции и вестерн-блот-анализах с помощью поликлонального антитела, полученного против C-конца pUL71 (аминокислоты [aa] 162–361) ( 14 ). В экспериментах по непрямой иммунофлуоресценции и анализах расширения фокуса в качестве вторичных антител использовались козьи антикроличьи и козьи антимышиные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor (AF) 488 или AF555 (Invitrogen). В качестве вторичных антител в анализах вестерн-блоттинга использовались козьи антимышиные или козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с StarBright Blue 700 или StarBright Blue 520 (Bio-Rad).
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание.
HFF были посеяны в 8-луночных слайдах μ-Slide (Ibidi GmbH; Германия) и синхронизированы путем голодания сыворотки в течение 48 ч до заражения соответствующими вирусами при множественности заражения (MOI) 1. В разное время после заражения клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 10 мин при 4°C. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано ранее ( 16 , 25 ). Вкратце, клетки были пермеабилизованы 0,1% Triton X-100, а неспецифические сайты связывания были блокированы PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина и 10% человеческой сыворотки от ЦМВИ-отрицательных лиц. Первичные и вторичные антитела были разведены в блокирующем растворе. ДНК окрашивали 30 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; Roche), разведенного в PBS. Конфокальные изображения получали с помощью объектива 63× флуоресцентного микроскопа Axio-Observer.Z1, оснащенного Apotome, а изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения Zen 2.3 (Zeiss).
Анализ роста вирусов.
Для экспериментов по многоэтапной кинетике роста конфлюэнтные HFF инфицировались в трех повторностях с частотой заражения приблизительно 0,3% для каждого вируса. Титры инокулята рассчитывались на основе фактической частоты заражения, которая определялась через 24 ч после заражения путем обнаружения IE-позитивных клеток. Первые супернатанты собирались через 24 ч после заражения путем удаления входящего вируса с последующими тремя промывками теплым PBS, добавлением полной MEM и инкубацией в течение 10 мин при 37 °C (день 1). Дополнительные супернатанты собирались на 3, 6, 9 и 12 день после заражения. Все супернатанты хранились при температуре -80 °C до титрования.
Для экспериментов по одноэтапной кинетике роста конфлюэнтные HFF были инфицированы в дубликатах при MOI 3. Для контроля за той же начальной инфекцией выход вируса инокулята определялся на HFF путем титрования. Введенный вирус удалялся, клетки промывались теплым PBS, и свежий MEM добавлялся через 90 минут после заражения. Супернатанты собирались каждые 24 часа и хранились при температуре -80°C. Определение выхода вируса в инокуляте и собранных супернатантах из экспериментов по многоэтапной и одноэтапной кинетике роста проводилось в трех повторах путем титрования на HFF, как описано ранее ( 14 ).
Способность клеточно-ассоциированного распространения определялась в анализе на расширение фокуса, как описано ранее ( 25 ). Вкратце, конфлюэнтные HFF в 12-луночных планшетах (2 × 10 5 HFF/лунку) были инфицированы 50, 100 и 150 БОЕ/лунку соответствующего вируса. Через 24 часа клетки тщательно промывали теплым PBS и культивировали еще 24 часа в свежей MEM. Клетки содержались под слоем 0,65% метилцеллюлозы с 3 дней после заражения до тех пор, пока среда не была удалена, а затем клетки промывали теплым PBS и фиксировали ледяным метанолом в течение 10 минут при -20°C на 9-й день заражения. Клетки, инфицированные ЦМВИ, были обнаружены путем окрашивания антигена IE1/2. Ядра были контрастно окрашены DAPI. Эксперимент повторяли три раза, и не менее 50 очагов каждого эксперимента и вируса были получены в флуоресцентном микроскопе Axio-Observer.Z1 с объективом 10×. Количество IE-положительных ядер каждого очага определяли с помощью программного обеспечения ImageJ ( 64 ) с плагином cell-counter (
https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ; Курт Де Вос, Университет Шеффилда, Академическая неврология). Средний размер очага для каждого вируса рассчитывали и нормализовали по среднему размеру очага в лунках, инфицированных TB40-BAC4, а статистический анализ проводили с помощью теста Крускала-Уоллиса ( P < 0,05) с последующим тестом множественного сравнения Данна ( P < 0,05).
Электронная микроскопия.
Подготовка образцов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и количественные исследования морфогенеза вируса с помощью ПЭМ были выполнены, как описано ранее ( 3 ). Короче говоря, HFF выращивались на покрытых углеродом сапфировых дисках (диаметр 3 мм, толщина 50 мкм; Wohlwend GmbH), инфицированных соответствующими вирусами при MOI 1 и зафиксированных через 120 ч после заражения путем замораживания под высоким давлением (HPF Compact 01; Wohlwend GmbH) с последующим замещением замораживанием ( 13 ) и пошаговым встраиванием в эпоксидную смолу (Fluka). Ультратонкие срезы толщиной 70 нм клеток, инфицированных ЦМВИ, исследовались с помощью ПЭМ JEM-1400 (Jeol), оснащенного камерой с зарядовой связью (CCD), при ускоряющем напряжении 120 кВ. Оболочечные, почкующиеся и голые цитоплазматические капсиды количественно определялись на микрофотографиях областей vAC случайно выбранных инфицированных вирусом клеток из по меньшей мере трех независимых экспериментов для каждого вируса.
Фиксация и внедрение инфицированных клеток для STEM-томографии были такими же, как описано для TEM. Последующие этапы подготовки образцов проводились, как описано ранее ( 65 , 66 ). Вкратце, срезы инфицированных клеток толщиной от 500 до 700 нм были подготовлены и закреплены на сетках EM с 200 параллельными прутьями сетки (Plano), которые были предварительно обработаны поли- l -лизином (10% в воде). Закрепленные срезы были снова обработаны поли- l -лизином перед прикреплением коллоидных золотых проверочных знаков и, наконец, покрыты слоем углерода толщиной 5 нм. Получение томограммы проводилось на STEM JEM-2100F (Jeol) с ускоряющим напряжением 200 кВ. Серии наклонов были получены от по крайней мере +68° до −68° с шагом 1,5° с использованием детектора светлого поля. Серии изображений были реконструированы в томограммы с помощью взвешенной обратной проекции с помощью программного пакета IMOD ( 67 ). Расстояние между двумя плечами обертывающей везикулы измерялось по виртуальным сечениям томограмм почкующихся капсидов с помощью программного обеспечения IMOD ( рис. 7 ). Расстояния были определены для 62 капсидов мутанта TB71mutK348-351A по 11 томограммам и 5 капсидов вируса TB40-BAC4 по 8 томограммам. Кроме того, расстояние между ядром ДНК и мембраной (толщина тегумента плюс толщина оболочки капсида) измерялось в виртуальных сечениях для 38/75 (обернутых/почкующихся) капсидов по 11 томограммам мутантного вируса и 26/9 (обернутых/почкующихся) капсидов по 8 томограммам вируса дикого типа. Трехмерная визуализация почковавшихся капсидов была выполнена с использованием программного обеспечения Avizo 6.3 (Visualization Science Group, Берлингтон, Массачусетс, США) путем ручной сегментации мембраны и структуры капсида. Пороговая сегментация использовалась для визуализации плотностей тегумента в этих трехмерных реконструкциях.
Уважаемейшая,
Pipa, в этих описанных модификациях кроется и специфическая ВИДОВАЯ активность некоторых вирусов тока в рамках нкого вида животных, что не исключает и появления высоко-патогенных штаммов, именно ввиду проявления СИНЕРГЕТИКИ в специфике сборки Вирионов и в других видах с появлением Пандемий. Но такие вирусы должны быстро вырождаться, ибо у них эволюционная настройка тока на другой вид животных, и они не могут эволюционировать в рамках только человеческих существ.
